固相萃取- 超高效液相色譜- 串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定地表水中5 種磺胺類(lèi)抗生素

付曉燕

（遼寧省大連生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)中心，遼寧大連 116023）

1 引言

磺胺類(lèi)抗生素是一種被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、畜牧業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的抗菌藥物，特點(diǎn)是高水溶性、低螯合能力，施用于動(dòng)物后大部分會(huì)以原藥或代謝物的形式，經(jīng)動(dòng)物糞便和尿液排出并最終進(jìn)入環(huán)境，從而對(duì)環(huán)境水體造成嚴(yán)重污染［1-3］。其在環(huán)境中的殘留和長(zhǎng)期存在，脅迫微生物產(chǎn)生耐藥性，并可能通過(guò)基因水平轉(zhuǎn)移方式傳遞到其他菌群，進(jìn)一步通過(guò)食物鏈傳遞到人體，威脅人類(lèi)生命安全。由于磺胺類(lèi)藥物具有較強(qiáng)的極性及在環(huán)境樣品中含量低的特點(diǎn)，導(dǎo)致對(duì)其分析檢測(cè)難度增加［4-5］。

目前磺胺類(lèi)抗生素的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法（HPLC）、氣相色譜法（GC）、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）、微生物檢測(cè)法以及TTC 法等，但技術(shù)面向?qū)ο笾饕鞘称匪幤沸袠I(yè)，環(huán)境水體中磺胺類(lèi)抗生素的檢測(cè)技術(shù)很少［6-7］，而且這些檢測(cè)方法對(duì)應(yīng)的前處理方法用時(shí)久，操作復(fù)雜，且耗費(fèi)大量有機(jī)溶劑。為了簡(jiǎn)化前處理程序，提高工作效率，本研究采用固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜技術(shù)，建立了水質(zhì)磺胺類(lèi)抗生素的檢測(cè)方法。該方法高效、準(zhǔn)確、靈敏度高，能夠?yàn)樗|(zhì)磺胺類(lèi)抗生素的監(jiān)測(cè)工作和飲用水的質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)與技術(shù)支持。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

儀器：ACQUITY UPLC 超高效液相色譜儀，Waters TQ Detector 新型離子源加熱型質(zhì)譜儀；色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；Milli-Q 超純水器；固相萃取柱，填料為二乙烯苯和N-乙烯基吡咯烷酮共聚物；0.22 μm 有機(jī)相針筒式微孔濾膜過(guò)濾器，材質(zhì)為玻璃纖維、親水性聚丙烯、親水性聚四氟乙烯（PTFE）等。

試劑：甲醇為HPLC 級(jí)（美國(guó)J. T. Baker 公司）；甲酸為HPLC 級(jí)（美國(guó)Sigma 公司）；實(shí)驗(yàn)用水為經(jīng)Milli-Q 凈化系統(tǒng)制備的超純水（經(jīng)0.22 μm 過(guò)濾膜）；氮?dú)狻鍤猓兌取?9.999%）；其他試劑均為分析純；磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺甲唑及磺胺甲基嘧啶-13C6標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，純度均≥99%（百靈威公司）。

2.2 色譜條件

ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm × 100 mm，1.7 μm），流動(dòng)相為甲醇-0.1%的甲酸水溶液（梯度洗脫條件見(jiàn)表1）；流速0.2 mL/min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

表1 液相色譜流動(dòng)相線性梯度洗脫程序

2.3 質(zhì)譜條件

電離方式為電噴霧電離ESI+，檢測(cè)方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（Multiple Reaction Monitor，MRM）方式，利用保留時(shí)間和碎片信號(hào)比值判斷定性結(jié)果；電噴霧電壓3 kV；離子源溫度120 ℃；去溶劑溫度350 ℃。具體質(zhì)譜分析參數(shù)見(jiàn)表2。

2.4 樣品制備

取水樣100 mL，經(jīng)0.45 μm 濾膜減壓過(guò)濾。采用HLB 固相萃取柱萃取。分別用10 mL 甲醇、10 mL超純水活化HLB 萃取柱。將水樣以小于5 mL/min 的流速通過(guò)固相萃取柱，上樣完畢后，用10 mL 超純水淋洗小柱，再用氮?dú)獯蹈尚≈笥?0 mL 甲醇洗脫富集后的固相萃取柱，并用接收管接收甲醇洗脫液，氮吹濃縮至近干，加甲酸溶液定容至1.0 mL，最后加入內(nèi)標(biāo)使用液10.0 μL，經(jīng)0.22 μm 濾膜過(guò)濾，置于進(jìn)樣瓶中，等待進(jìn)樣。

3 結(jié)果與討論

3.1 液相色譜條件的優(yōu)化

磺胺類(lèi)抗生素分子具有較強(qiáng)的極性，在大部分反相色譜柱上，即使以純水做流動(dòng)相，依然只有很弱的保留［5］，因此選擇合適的色譜柱對(duì)磺胺類(lèi)抗生素的分析測(cè)定至關(guān)重要。本研究結(jié)果表明，ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）色譜柱對(duì)目標(biāo)物具有最佳的色譜分離效果，且在10 min 內(nèi)目標(biāo)物完全分離。流動(dòng)相的組成不僅影響目標(biāo)化合物的色譜峰形和分離效果，還會(huì)影響其離子化效率和質(zhì)譜檢測(cè)靈敏度。本研究考察了不同比例有機(jī)相（30%，50%及60%）的分離效果，最終確認(rèn)甲醇-水（30∶70，V/V）為主要洗脫梯度，含0.1%的甲酸體系，具有最佳的電離效果和質(zhì)譜特征。

3.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

根據(jù)磺胺類(lèi)抗生素分子結(jié)構(gòu)的特征和化學(xué)電離性質(zhì)，實(shí)驗(yàn)選擇了ESI+作為離子化模式。為了獲得最佳的靈敏度和分離效果，首先采用連續(xù)直接進(jìn)樣，掃描范圍為m/z 10～300，分別對(duì)電噴霧電壓、離子源溫度、去溶劑溫度、錐孔電壓、碰撞電壓等條件進(jìn)行優(yōu)化，使調(diào)諧液中磺胺類(lèi)抗生素的離子化效率達(dá)到最佳。磺胺類(lèi)抗生素和內(nèi)標(biāo)物的總離子流圖見(jiàn)圖1。

圖1 磺胺類(lèi)抗生素和內(nèi)標(biāo)物的總離子流圖

3.3 檢出限和標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍

在選定的色譜條件和質(zhì)譜條件下進(jìn)行測(cè)定，磺胺類(lèi)抗生素質(zhì)量濃度為5.0～100.0 μg/L 時(shí)，峰面積和濃度呈良好的線性關(guān)系，磺胺類(lèi)抗生素的線性方程及線性相關(guān)系數(shù)r 見(jiàn)表3。配制估測(cè)值濃度的實(shí)驗(yàn)室空白加標(biāo)平行樣7 個(gè)，按樣品分析全過(guò)程進(jìn)行分析測(cè)定，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差，根據(jù)MDL＝t（n-1，0.99）×S 計(jì)算，本方法磺胺類(lèi)抗生素的檢出限見(jiàn)表3。

表3 5 種磺胺類(lèi)抗生素的線性方程、回收率和精密度

3.4 加標(biāo)回收率和精密度

以經(jīng)測(cè)定不含有磺胺類(lèi)抗生素的碧流河水庫(kù)水為基質(zhì)，添加高（5.0 μg/L）、中（20.0 μg/L）、低（100.0 μg/L）3 個(gè)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按優(yōu)化完成的實(shí)驗(yàn)條件，每個(gè)添加濃度重復(fù)6 次，分別進(jìn)行加標(biāo)回收率和精密度的測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。

4 結(jié)論

本方法建立了固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀對(duì)水中5 種磺胺類(lèi)抗生素的快速分析方法，著重研究了超高效液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀對(duì)水中5 種磺胺類(lèi)抗生素的快速測(cè)定。該方法通過(guò)固相萃取法進(jìn)樣分析，節(jié)省了水樣前處理過(guò)程中需要消耗的大量有機(jī)溶劑及衍生試劑，并縮短了檢測(cè)時(shí)間，方法檢測(cè)限低至0.009 μg/L，是一種分析速度快、定性準(zhǔn)確、靈敏度高、穩(wěn)定性好的分析方法，能夠滿(mǎn)足《國(guó)務(wù)院關(guān)于印發(fā)水污染防治行動(dòng)計(jì)劃的通知》（國(guó)發(fā)〔2015〕17 號(hào)）中限制使用抗生素等化學(xué)藥品開(kāi)展專(zhuān)項(xiàng)整治的需要，可用于水中磺胺類(lèi)抗生素的監(jiān)測(cè)和環(huán)境質(zhì)量控制工作，可進(jìn)一步推廣使用。