滇重樓葉片多糖提取工藝優(yōu)化研究

楊青 李甜甜 楊羚鈺 茹瑞紅 陳顯梅

(云南省文山壯族苗族自治州農(nóng)業(yè)科學院 云南文山 663099)

滇重樓［Paris polyphyllaSmith var．yunnanensis（Franch.） Hand. -Mazz］是 黑 藥 花 科Melanthiaceae 重樓屬Paris 多年生草本植物，是傳統(tǒng)名貴中藥材［1］，2015 年中國藥典收錄主要種之一［2］。現(xiàn)代研究表明，重樓具有抗腫瘤、抗缺血性損傷、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、止血、鎮(zhèn)痛、抗菌、抗血小板聚集、抗炎等生物活性，是云南白藥、宮血寧膠囊、樓蓮膠囊、清咽膠囊、季德勝蛇藥片、熱毒清膠囊、金復康口服液等中成藥的主要原料［3-5］，含有甾體皂苷、蛻皮激素、甾醇、甾醇苷、黃酮苷、氨基酸、脂肪酸、微量元素、多糖等多種化學成分［6］。目前國內(nèi)外對重樓屬植物的研究報道主要集中在生藥學鑒定、化學成分的分離提取、人工栽培、組織培養(yǎng)及快速繁殖、總皂苷的活性研究、臨床應用等方面，多糖亦為重樓活性成分之一，但有關(guān)重樓多糖的研究相對較少［7］。重樓多糖有很好的藥理作用，多糖及其復合物分子所具有的復雜的、多方面的生物活性已引起了生物學界、化學界、醫(yī)藥界的極大興趣，目前已有豬苓多糖、香菇多糖、靈芝多糖、桔梗多糖等應用于臨床［8-10］。有研究表明，滇重樓多糖具有顯著的免疫增強作用［11］，以及抗炎、抗病毒、抗輻射等功效［12-18］。在提取方法上，采用了回流提取、超聲輔助提取和熱水提取等方法，優(yōu)化工藝分別采用了正交法和反應面法［19-23］，但是結(jié)果差異較大，有必要進行實驗驗證和方法確定。本實驗將采用超聲波輔助提取法從滇重樓中提取多糖，利用單因素和正交設(shè)計優(yōu)化提取方法，以期最大程度提高滇重樓多糖得率，為進一步深入研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試材

滇重樓樣品采集于云南省西疇縣西灑鎮(zhèn)，并經(jīng)長期從事重樓研究工作的高級農(nóng)藝師陳達菊鑒定為黑藥花科植物滇重樓Paris polyphyllavar.yunnanensis的葉片。

1.1.2 試劑

無水葡萄糖對照品、無水乙醇、石油醚、苯酚、濃硫酸、蒽酮溶液、氯仿、碘化鉀、三氯甲烷、丙酮、乙醚。以上試劑均為分析純。a-淀粉酶為生化試劑，購自北京奧博星生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 實驗儀器

超純水制造系統(tǒng)（成都超純科技有限公司）；高速多功能粉碎機（浙江永康市天棋盛世工貿(mào)有限公司）；數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；GL-2050M 高速冷凍離心機（湖南賽特湘儀離心機儀器有限公司）；UV-2450 型紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；SB-5200DTN 型超聲波清洗機 （寧波新芝生物科技股份有限公司）；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋 （江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司）；RV10 basic V 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀德國IKA 集團；eppendorf 移液器（德國eppendorf）；boekel 干浴鍋（美國）；HG-9145A 電熱恒溫鼓風干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）；MS204S/01 電子天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）等。

1.2 方法

1.2.1 滇重樓葉片多糖提取優(yōu)化

1.2.1.1 單因素實驗

把新鮮滇重樓葉片清洗干凈，40℃殺青1 h，60℃烘干，打粉，過40 目篩。精確稱取10 g 重樓葉片粉末各3份，分別置于圓底燒瓶中，用適量石油醚回流脫脂，脫脂后分別按料液比精密量取超純水倒入錐形瓶中，用甲醇浸提，去提取液，然后置于恒溫水浴鍋中進行提取。單因素實驗，除去考察因素，其他實驗條件為溫度80℃，料液比1∶20，提取時間60 min，提取次數(shù)1 次。每個處理設(shè)3個重復。單因素實驗設(shè)計如下：

（1）在提取溫度80℃，提取時間60 min，提取1 次的條件下，考察不同料液比（1∶20、1∶40、1∶60、1∶80、1∶100）對滇重樓葉片多糖提取率的影響。

（2）在提取溫度80℃，料液比為1∶20，提取1 次的條件下，考察不同提取時間（30、60、90、120、150 min）對滇重樓葉片多糖提取率的影響。

（3）在料液比為1∶20，提取時間60 min，提取1 次的條件下，考察不同提取溫度（70、80、85、90、95℃）對滇重樓葉片多糖提取率的影響。

（4）在提取溫度80℃，料液比為1∶20，提取時間60 min 的條件下，考察不同提取次數(shù)（1、2、3、4次）對滇重樓葉片多糖提取率的影響。

1.2.1.2 正交設(shè)計優(yōu)化提取

在單因素實驗基礎(chǔ)上，以時間、溫度、料液比、提取次數(shù)為考察因素，設(shè)計L9（34）正交實驗來確定提取滇重樓多糖的最佳提取工藝。根據(jù)單因素實驗的結(jié)果選取正交設(shè)計的因素和水平及編號，具體見表1。

表1 實驗設(shè)計

1.2.2 多糖的測定

1.2.2.1 標準溶液配制

準確稱取在105℃下干燥至恒重的葡萄糖0.05 g，加純水配制成濃度為0.1 mg/mL 的標準溶液備用。

1.2.2.2 繪制標準曲線

分別吸取上述標準溶液適量至試管中，加水補足2 mL，分別配成濃度為7.5、22.5、37.5、52.5、67.5 μg/mL 的溶液，置于冰水中再加入蒽酮溶液6 mL，搖勻，于100℃沸水浴顯色15 min，冷卻至室溫，以2 mL 純水作對照，加入顯色劑，相同條件下顯色，625 nm波長測吸光度。

1.2.3 樣品的測定

分別精密稱取經(jīng)過1.2.1.1 提取的滇重樓葉片多糖和量取1.2.2正交優(yōu)化工藝提取的滇重樓葉片粗多糖供試品溶液0.5～2.0 mL 至10 mL 具塞刻度試管中，照標準曲線的制備方法，準備各組供試樣品，依次在625 nm 波長測定吸光度，對照標準曲線計算出供試品溶液中多糖的濃度，計算公式如下［24］：

式中：C—由葡萄糖標準曲線計算得到的多糖含量；V—提取液定容體積（mL）；W—樣品取樣質(zhì)量（g）。

2 結(jié)果與分析

2.1 標準曲線制作

以葡萄糖檢測濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。即得標準曲線方程：

y=0.012X+0.014 4，R2=0.999 2。

2.2 滇重樓葉片多糖提取工藝的優(yōu)化

2.2.1 滇重樓葉片多糖提取工藝的單因素優(yōu)化

單因素實驗按1.2.1.1的實驗方法進行，然后檢測數(shù)據(jù)，根據(jù)標曲曲線方程式計算得到數(shù)據(jù)，見表2。從表2 可以看出，單因素最佳提取條件：時間60 min、溫度85℃、液料比80∶1、提取次數(shù)3次。

表2 不同單因素對滇重樓多糖含量的影響

2.2.2 滇重樓葉片多糖提取工藝的正交法優(yōu)化

采用1.2.1.2的方法進行優(yōu)化，采用紫外可見分光光度計進行檢測，數(shù)據(jù)按標準曲線方程計算得到各組合數(shù)據(jù)（表3）。由表3可知，滇重樓葉片多糖提取的各因素最優(yōu)組合為：時間30 min、溫度90℃、液料比80∶1、提取次數(shù)3次。

表3 不同組合對滇重樓多糖提取的影響

3 討論

有研究表明，滇重樓中的皂苷及多糖具有較強的生理活性，如抗癌、抗生育、抑菌、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、止咳平喘、止血、抗氧化、增強免疫等［12-18］，在臨床上主要用于治療出血、炎癥、癌癥等疾病［14-17］。李敏敏等［25］研究表明，重樓提取物對植物病原菌柑桔病原真菌、柑桔鏈格孢茵、柑桔褐腐疫霉菌、柑桔炭疽菌具有明顯抑制作用。滇重樓地上部分具有多種活性成分［18，25］。現(xiàn)代研究多集中于重樓地下部分，從塊根中提取皂苷等其他化學成分，而地上莖葉部分容易被丟棄，造成資源浪費，滇重樓地上莖葉生長速度快，還未得到很好地研究利用。從滇重樓莖葉中提取活性成分不僅能有效避免資源浪費，而且滇重樓葉中含有的活性成分多糖具有多種作用。重樓多糖的提取可以采用回流、超聲輔助和熱水提取等方法，運用熱水提取法成本較低、操作方便，比較適宜應用于工廠化大規(guī)模生產(chǎn)。本實驗對滇重樓葉片多糖采用熱水提取法進行了單因素和正交設(shè)計優(yōu)化，得到了優(yōu)化提取方案，為以后重樓地上部分的提取提供了參考方法，充實了數(shù)據(jù)，為滇重樓新資源擴充開發(fā)利用等方面奠定了基礎(chǔ)。