茶籽餅生物脫毒工藝的優化

管維 詹逸舒 李明紅 蘭時樂 管桂萍 文金

摘要 以茶籽餅中茶皂素降解率為主要指標，采用單因素試驗和正交試驗對嗜酸小球菌固體發酵茶籽餅的生物脫毒工藝條件進行了優化。結果表明，該菌適宜的生物脫毒工藝條件為茶籽餅粕85%、麥麩15%、葡萄糖3%、KH2PO4 0.1%、MgSO4·7H2O 0.15%、NaCl 3%、含水量70%、種齡24 h、發酵時間5 d、接種量20%、初始pH 6.0、發酵溫度32 ℃，在此優化工藝條件下茶籽餅中茶皂素的降解率可達到68.42%，比優化前提高了57.13%。

關鍵詞 嗜酸小球菌;茶籽餅粕;茶皂素;固態發酵

中圖分類號 S816? 文獻標識碼 A? 文章編號 0517-6611（2021）04-0175-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.04.048

Optimization of Tea Seed Cakes Biological Detoxification Process

GUAN Wei1， ZHAN Yi-shu2， LI Ming-hong3 et al

（1. Market Supervision and Administration Bureau in Nanyue District of Hengyang City， Hengyang， Hunan 421900; 2.Livestock and Fisheries Affairs Center in Changning City，Changning， Hunan 421500; 3.? Administration Bureau of Nanyue Hengshan National Nature Reserve， Hengyang， Hunan 421900）

Abstract Taking the degradation rate of tea saponin as the main index， the single-factor test and orthogonal test were used to optimize the biodetoxification process conditions of tea seed cake by solid fermentation of Pediococcus acidilactici. The results showed that the suitable detoxification process conditions of tea seed cake were as follows： 85% tea seed cake， 15% wheat bran， 3% glucose， 0.1% KH2PO4， 0.15% MgSO4·7H2O， 3% NaCl， 70% water content， seed age 24 h， inoculation amount 20%， initial pH 6.0， fermentation temperature 32 ℃.Under these conditions， the degradation rate of tea saponin in tea seed cake reached 68.42%， which was 57.13% higher than before optimization.

Key words Pediococcus acidilactici;Tea seed cake;Tea saponin;Solid state fermentation

作者簡介 管維（1986—），女，湖南衡陽人，工程師，碩士，從事質量檢驗工作。

收稿日期 2020-06-15

茶籽餅，又稱為茶粕、茶枯，是油茶果實榨油后剩下的渣滓[1]。據國家統計局統計，2010年我國油茶種植面積達到200余萬hm2，年產油茶籽109萬t，油茶籽粕70多萬t[2]。但是，由于茶籽餅粕中含有茶皂素等毒性物質以及單寧、粗纖維等抗營養成分，限制了其在動物飼料中的應用范圍。目前主要采用物理法、化學法、微生物發酵法[3-9]以及綜合法對茶籽餅粕進行脫毒處理，常用的方法有化學法與微生物發酵法[10]。其中，茶籽餅粕微生物發酵脫毒國內外進行了研究。丁麗霞[3]以油茶粕為研究對象，以茶皂素含量為指標，利用黑曲霉對油茶粕進行固態發酵降解茶皂素，在最優工藝條件下降解率達到89.99%。練杰等[11]利用黑曲霉、枯草芽孢桿菌的混合菌對茶籽餅粕進行固態發酵，在最優工藝條件下可使茶籽粕的茶皂素降解率約為93.28%。黃浦[12]利用混菌液態發酵降解茶皂素，在最佳條件下進行混菌液態發酵試驗，結果表明混菌降解茶皂素的降解率為（73.76±0.63）%。王小姣等[13] 對飼用嗜酸小球菌液體生料發酵工藝研究，結果表明液體生料發酵技術適合于飼用嗜酸小球菌的生產。

筆者以茶皂素降解率為考察指標，對茶籽餅進行微生物固體發酵脫毒工藝進行了研究，首先通過單因素試驗法優化發酵培養基的組成（茶籽餅與麥麩的比例、葡萄糖添加量、KH2PO4添加量、MgSO4·7H2O添加量）及發酵條件（含水量、發酵時間、接種量、初始pH、種齡），然后選取對發酵影響顯著的因素進行正交優化。該研究優化了茶籽餅生物脫毒工藝條件，為微生物發酵茶粕飼料提供了發酵工藝條件，為使茶籽餅成為一種優良的蛋白飼料資源打下了堅實的基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種。

試驗菌種為嗜酸小球菌（Pediococcus acidilactici），聯合湖南農業大學生物科學技術學院微生物實驗室對衡陽市荊田灣農業開發有限公司提供的自然堆放的茶籽餅粕原料進行篩選所得的菌種。

1.1.2 主要試劑。

茶皂素標準品（98.2%茶皂素）購自陜西帕尼爾生物科技有限公司;茶籽餅、麥麩（市場購得，無霉變與蟲蛀）、葡萄糖、NaCl、MgSO4·7H2O、MnSO4·4H2O、檸檬酸二銨、無水乙酸鈉、吐溫-80、香草醛、甲醇（AR級）、濃 H2SO4、牛肉膏、蛋白胨（BR級，上海盛思生化科技有限公司）;酵母膏（BR級，上海天鵝啤酒有限公司）;瓊脂、酵母抽提粉。

1.1.3 主要儀器與設備。

紫外可見分光光度計（752型，上海光譜儀器有限公司）;恒溫水箱（SHHW21.420AII，天津市泰斯特儀器有限公司）;臺式低速離心機（TDZ4，湖南赫西儀器裝備有限公司）;高速多功能粉碎機（TYSP-400A，浙江省永康市紅太陽機電有限公司）;超聲波清洗機（JCX-250W，山東濟寧超聲電子儀器廠）;電子天平（KF型，浙江凱豐集團有限公司）。

1.1.4 培養基。

1.1.4.1

MRS培養基（培養嗜酸小球菌）。蛋白胨1%、牛肉膏1%、酵母膏0.5%、葡萄糖2%、吐溫80 0.1 mL、K2HPO4 0.2%、醋酸鈉0.5%、檸檬酸二銨0.2%、MgSO4·7H2O 0.058%、MnSO4· 4H2O 0.025%、蒸餾水100 mL，pH 6.2～6.6，115 ℃下滅菌25 min。

1.1.4.2

基礎液體發酵培養基。茶皂素15.0 g、葡萄糖5 g、蛋白胨5 g、KH2PO4 2 g、MgSO4·7H2O 1 g、酵母抽提粉3 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.2～7.5，121 ℃下滅菌25 min。

1.1.4.3

基礎固體發酵培養基。茶籽餅粕90%、麥麩10%、葡萄糖4%、KH2PO4 0.15%、MgSO4·7H2O 0.1% 、NaCl 3%，pH 7.5，固水比1∶0.5。

1.2 方法

1.2.1 種子液初步培養及固體發酵培養。

1.2.1.1

種子液初步培養。將斜面菌種接種于種子液培養基中，于30 ℃﹑160 r/min 條件下培養24 h，備用;嗜酸小球菌接種于MRS培養基中，在培養溫度37 ℃的恒溫培養箱中靜置培養24 h，備用。

1.2.1.2

種子液固體發酵培養。在250 mL三角瓶中裝入50 g 固體發酵培養基（以干基計），采用接種量為10%（V/w），將培養好的種子液接入基礎固體發酵培養基中，32 ℃恒溫培養5 d。

1.2.2

固體發酵樣品茶皂素降解率的測定。采用香草醛-濃硫酸法[14-15]測定固體發酵樣品茶皂素的降解率。按照以下公式計算茶皂素降解率：茶皂素降解率=（發酵后茶皂素濃度/發酵前茶皂素濃度）×100%。

1.2.3 固體發酵培養基的優化。

保持基礎培養基其他組成不變，采用單因素試驗法，依次改變培基的茶籽餅與麥麩的添加比例（95∶5、90∶10、85∶15、80∶20、75∶25）、葡萄糖添加量（2%、3%、4%、5%、6%）、KH2PO4添加量（0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%）、MgSO4·7H2O添加量（0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%），等量接種種子液培養液于固體發酵培養基中進行固體發酵。測定發酵前后茶籽餅中茶皂素濃度，以茶皂素降解率為指標，優化篩選不同茶籽餅與麥麩的比例、葡萄糖添加量、KH2PO4添加量、MgSO4·7H2O添加量等對菌種降解茶皂素的影響。每個處理3個平行。

1.2.4 固體發酵條件的優化。通過改變影響發酵的條件，測定發酵前后茶籽餅中茶皂素的濃度，以茶皂素降解率為考察指標，在“1.2.3”優化培養基的基礎上，考察含水量、發酵時間、初始pH、接種量以及種齡對茶皂素降解率的影響，研究最佳固體發酵條件。每個處理3個平行。

在單因素試驗的基礎上，采用正交試驗法[10]設計用含水量、初始pH、接種量、種齡等對嗜酸小球菌降解茶皂素影響較大的因素進行4因素3水平正交試驗。正交試驗因素與水平設計見表1。

1.2.5 數據處理。試驗數據均使用WPS Office 軟件進行誤差分析。

2 結果與分析

2.1 茶籽餅茶皂素含量的測定

利用香草醛-濃硫酸方法繪制茶皂素標準曲線（圖1），得到線性回歸方程y=0.610 7x+0.010 5，R2=0.992 8，表明茶皂素濃度與吸光度的線性關系良好。采用香草醛-濃硫酸方法測得茶籽餅1 g中含茶皂素0.174 5 g，即茶皂素含量為17.45%。

2.2 固體發酵培養基的優化

2.2.1 茶籽餅與麥麩的添加比例。

改變培養基中茶籽餅與麥麩的添加比例（95∶5、90∶10、85∶15、80∶20、75∶25）在其他條件不變的情況下，32 ℃恒溫發酵5 d，80 ℃烘干后測定培養基中的茶皂素含量并計算茶皂素的降解率，結果見圖2。從圖2可以看出，當茶籽餅與麥麩的添加比例為85∶15時，茶皂素降解率最高（11.29%）。在一定范圍內，茶皂素降解率隨茶籽餅比例的增加而增大，說明茶皂素的增加在一定范圍內能夠加強菌體的生長繁殖能力，但當茶籽餅所占比例過大時，培養基中的茶皂素濃度高，對菌體的生長代謝起抑制作用，從而影響對茶皂素的降解率。因此，選擇茶籽餅與麥麩的添加比例為85∶15，用于后續研究。

2.2.2 葡萄糖添加量。

在其他條件不變的情況下，改變培養基中葡萄糖的添加量，32 ℃恒溫發酵5 d，80 ℃烘干后，測定培養基中的茶皂素含量并計算茶皂素的降解率，結果見圖3。從圖3可以看出，當葡萄糖添加量為2%～3%時，茶皂素降解率隨葡萄糖添加量的增加而增加;當葡萄糖添加量為3%時，茶皂素降解率達到33.07%，但當葡萄糖添加量大于3%時，茶皂素降解率顯著且持續下降。究其原因，可能是由于培養基中碳含量過高或過低，從而使培養基中的碳氮比例失調，導致菌體生長代謝能力下降。因此，選擇3%作為葡萄糖的最佳添加量。

2.2.3 KH2PO4添加量。

在其他條件不變的情況下，改變培養基中KH2PO4添加量，32 ℃恒溫發酵5 d，80 ℃烘干后測定培養基中的茶皂素含量并計算茶皂素的降解率，結果見圖4。從圖4可以看出，在一定范圍內，茶皂素降解率隨KH2PO4添加量的增加而增加，當KH2PO4添加量為0.1%時茶皂素降解率達到41.38%，但當KH2PO4添加量超過0.1%茶皂素降解率隨著KH2PO4添加量的增加而下降。磷是微生物細胞中核蛋白、核酸、ATP、磷脂、輔酶等的重要原料，能保持細胞內ATP代謝的平衡，參與調節體內的酸堿平衡，參與體內能量的代謝。若培養基中磷含量不足，會影響微生物的代謝生長速度，但若磷含量超過微生物生長代謝的需要量，則會對微生物的生長起抑制作用。因此，選擇0.1%作為KH2PO4的最佳添加量。

2.2.4 MgSO4·7H2O添加量。

改變培養基中MgSO4·7H2O的添加量（0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%），其他條件保持不變，32 ℃恒溫發酵5 d，80 ℃烘干后測定培養基中的茶皂素含量并計算茶皂素的降解率，結果見圖5。從圖5可以看出，在一定范圍內，茶皂素降解率隨MgSO4·7H2O添加量的增加而增加，當MgSO4·7H2O添加量為0.15%時茶皂素降解率最高（48.83%）。鎂參與能量代謝、蛋白質和核酸的合成及催化酶的激活和抑制等。若培養基中鎂含量過低，會導致細胞膜和核糖體的穩定性降低，對微生物營養的吸收與蛋白質的合成產生影響，從而影響機體的正常生長代謝;若鎂含量過高，則會對微生物生長代謝起抑制作用。因此，選擇0.15%作為MgSO4·7H2O的最佳添加量。

2.3 固體發酵條件的優化

2.3.1 含水量。在上述篩選出的培養基配方的基礎上，改變培養基的含水量，培養后測定茶皂素含量并計算茶皂素降解率，結果見圖6。從圖6可以看出，當含水量為40%～70%時，茶皂素降解率隨著含水量的增加而增加。當含水量為70%時茶皂素降解率最大，達到60.97%;當含水量超過70%時，茶皂素降解率顯著降低。茶籽餅遇水易凝結，含水量過高的培養基易結塊，菌體生長會受到抑制;當含水量過低時，培養基比較松散，不能給菌體提供適宜的生長環境。固體培養基的含水量是構成微生物生長代謝環境的重要因素，因此選擇70%作為培養基的最佳含水量。

2.3.2 發酵時間。

不同發酵時間對茶皂素降解率的影響如圖7所示。從圖7可以看出，發酵初期隨著時間的增加，茶皂素降解率逐漸增加，當發酵時間為5 d時茶皂素降解率基本不發生變化，即培養基經過5 d發酵后，茶皂素降解率趨于穩定。因此，選擇5 d作為后續研究的發酵時間。

2.3.3 接種量。

不同接種量對茶皂素降解率的影響如圖8所示。由圖8可知，不同接種量對茶皂素降解率影響顯著。當接種量為15%時，茶皂素降解率最大，達到66.19%;當接種量小于15%時，茶皂素降解率隨接種量的增加而增加;當接種量大于15%時，茶皂素降解率隨接種量的增加而降低。若接種量過大，發酵前期菌體總數大，菌體大量生長使營養物質消耗過快，且液體種子液的副產物過多，導致發酵延滯期延長，從而引起相同的發酵周期茶皂素降解率降低。因此，選擇15%作為最佳接種量，用于后續研究。

2.3.4 初始pH。

不同初始pH對茶皂素降解率的影響如圖9所示。從圖9可以看出，初始pH對菌體生長代謝的影響顯著，在一定范圍內隨著培養基初始pH的升高，茶皂素降解率隨之增加。當初始pH為6.5時，茶皂素降解率最大，達到67.85%。不同的微生物都有適合生長的pH范圍及最適生長pH，嗜酸小球菌的生長pH偏酸性范圍，試驗表明當初始pH處于酸性范圍內時，培養基中的茶皂素降解率大于初始pH處于堿性范圍內;若初始pH過高或過低則會影響菌體內酶的活性和穩定性，影響營養物質的溶解度及微生物對營養的吸收。因此，選擇6.5作為培養基的最佳初始pH。

2.3.5 種齡。

不同種齡對茶皂素降解率的影響如圖10所示。從圖10可以看出，當種齡為24 h時，茶皂素降解率最大，達到68.65%。當種齡較低時，菌體處于延滯期，導致細胞增長速率過慢，從而延長了延滯期;當種齡偏高時，菌體老化，菌種活力減弱，代謝產物增多，從而延長了發酵周期。因此，選擇24 h作為最佳種齡。

2.3.6 正交試驗。

采用正交試驗法，選擇對茶皂素降解率影響較大的因素（含水量、初始pH、接種量、種齡）進行4因素3水平L9（34）正交試驗。正交試驗結果見表2。

由表2可知，根據極差R大小可知，各因素對茶皂素降解率的影響從大到小依次為含水量、初始pH、種齡、接種量。試驗條件下最優組合為A3B1C3D2。發酵培養基的最優組合為茶籽餅85%、麥麩15%、葡萄糖3%、KH2PO4 0.1%、MgSO4·7H2O 0.15%、含水量70%，最佳培養條件為初始pH 6.0、接種量為20%、種齡為24 h、發酵時間5 d、發酵溫度32 ℃。在此工藝條件下，茶皂素降解率達到68.42%，比優化前提高了57.13%。

3 結論與討論

微生物發酵法是茶籽餅粕降解的主要方法，被認為是目前發展潛力最大的茶籽餅粕脫毒處理方法。其原理是在茶籽餅粕中添加微生物進行發酵，使添加的微生物在發酵培養基上大量生長并同時將茶皂素分解利用，從而降低茶皂素的含量，達到去毒的目的。微生物在發酵過程中產生包括酶、促生長因子以及抗菌物質等有益的代謝產物，同時降低了茶籽餅粕中的單寧和纖維素等抗營養因子，加上使用的發酵微生物菌種本身是動物益生菌，能起到改善動物腸道微生態平衡的作用。

該試驗以茶籽餅為原料，對茶籽餅生物脫毒及其發酵工藝進行研究。通過單因素試驗和正交試驗考察了茶籽餅粕添加量、碳源、氮源、無機鹽種類及添加量、含水量、初始pH、種齡、接種量、發酵時間等因素對茶皂素降解率的影響，優化了發酵培養基的組成及發酵條件，最終得到最佳脫毒工藝條件。

該試驗結果表明，在茶籽餅脫毒過程中含水量與初始pH是影響茶皂素降解率的關鍵因素，茶籽餅與麥麩的添加比例85∶15、葡萄糖3%、KH2PO4 0.1%、MgSO4·7H2O 0.15%、含水量70%，最佳培養條件為初始pH 6.0、接種量20%、種齡24 h、發酵時間5 d、發酵溫度32 ℃。在此條件下茶皂素降解率為68.42%。在此工藝條件下，固態發酵培養基配制完成后無需滅菌，這在一定程度上降低了能耗，且操作簡單，對設備要求低，降低了生產成本，為茶籽餅生物脫毒技術的推廣提供了技術支持。

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