伊犁河谷地區牛病毒性腹瀉病毒基因型鑒定與分析

摘要 為摸清伊犁河谷地區牛場牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）感染的病毒基因型，利用BVDV基因組5′端非翻譯區（5′-UTR）通用型引物，采用一步法 RT-PCR對疑似感染樣品進行基因擴增、序列測定與比對分析以及遺傳進化樹構建。結果顯示：12份疑似樣品中，有1份樣品PCR擴增結果呈陽性，基因型鑒定為BVDV2型。該研究表明伊犁河谷規模化牛場內存在BVDV2型感染，為該地區規模化牛場病毒性腹瀉病的防控提供了理論依據。

關鍵詞 伊犁河谷;BVDV;基因型;鑒定

中圖分類號 S852.65+3? 文獻標識碼 A? 文章編號 0517-6611（2021）04-0082-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.04.021

Genotype Identification and Analysis of Bovine Viral Diarrhea Virus in Yili Valley Area

WANG Chuan-feng

（Yili Vocational and Technical College， Yining， Xinjiang 835000）

Abstract In order to find out the genotype of BVDV infection in cattle farms in Yili Valley area，using a universal primer for the 5′-UTR of the BVDV genome，gene amplification，sequencing and blasting，phylogenetic tree construction were conducted on suspected infection samples by one-step RT-PCR. The results showed that 1 of 12 suspected samples was PCR positive， and the genotype was identified as BVDV2. The results of the study indicated that there was BVDV2 infection in large-scale cattle farms in the Yili Valley，which provided theoretical basis for the prevention and control of BVD in large-scale cattle farms in this area.

Key words Yili Valley;BVDV;Genotype;Identification

基金項目 新疆維吾爾自治區高校科研計劃項目（XJEDU2016S094）。

作者簡介 王傳鋒（1982—），男，安徽淮南人，副教授，碩士，從事預防獸醫學研究。

收稿日期 2020-06-30

牛病毒性腹瀉病毒（bovine viral diarrhea virus，BVDV）屬于黃病毒科瘟病毒屬，主要引起牛病毒性腹瀉[1]。依據BVDV保守端基因5′-UTR序列的差異性，可將病毒分為2種基因型，即BVDV1和BVDV2。其中，國內外已對BVDV1進行了廣泛研究，許多經典菌株和常見的疫苗菌株都屬于該基因型。BVDV1型感染牛常常表現出發熱、腹瀉和黏膜潰爛等癥狀;BVDV2型感染牛通常發病較急，臨床表現主要為高熱、下痢、血小板減少癥、黏膜出血、呼吸困難并伴有流產和高死亡率[2]。感染BVDV的患畜，病毒存在于血清、凍精和胚胎中，以此為原料生產的生物制品將會給牛場和生物制品制造企業造成巨大的經濟損失。Olafson 等[3]首次在感染牛腸道及排泄物中發現BVDV。目前，該疾病在世界范圍內流行，尤其是在發達國家規模化牛場中。近年來，新疆牛病毒性腹瀉病的流行形式也發生了一定的變化，由原來較多見的隱性感染和散發性病例演變為現今的地方性流行和暴發，加上BVDV基因型的多樣性、免疫耐受性以及在患畜體內產生的持續性感染給防控該病帶來了一定的困難。筆者采用一步法RT-PCR技術從采集的疑似病料（肛拭子）中擴增目的片段，并進行 BVDV基因分型鑒定，以期掌握伊犁河谷地區規模化牛場 BVDV 流行株的基因型，分析此基因型與國內外其他地區BVDV病毒株之間的關系，為防控該病提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

伊犁河谷地區部分規模化牛場，采集疑似犢牛腹瀉樣品（肛拭子）共12份，置于-20 ℃冰箱中保存備用。

1.2 主要試劑與儀器設備

1.2.1 主要試劑。

RNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒均購自北京鼎國生物科技有限公司;高純質粒小量制備試劑盒購自百泰克生物技術（北京）有限公司;PrimeScriptTM One Step RT-PCR Kit生物制劑購自TaKaRa 生物工程有限公司。

1.2.2 主要儀器與設備。PCR擴增儀（型號T100，美國Bio-Rad公司）;全自動凝膠成像系統（型號K8300，南京世研儀器設備有限公司）;凝膠電泳儀（型號DYCP-44N，北京六一生物科技有限公司）;電泳儀電源（DYY-5D型，北京六一生物科技有限公司）;低溫高速離心機（型號5418R，德國Eppendorf公司）。

1.3 引物

根據已知牛病毒性腹瀉病毒5′-UTR特異性通用型引物擴增目的基因，預估擴增片段大小為267 bp，引物由北京鼎國生物科技有限公司合成。上游引物（5′-UTR-F）為5′-CCTAGCCATGCCCTTAGTAGGACT-3′，

下游引物（5′-UTR-R）為5′-GGAACTCCATGTGCCATGTACA-3′。

1.4 BVDV參考毒株

試驗所用參考株序列均來源于GenBank數據庫，具體如表1所示。

1.5 總RNA提取

參照RNA提取試劑盒使用說明書中的方法對12份檢測樣品進行總RNA提取。

1.6 一步法RT-PCR擴增

以疑似樣品中提取的總RNA為模板，根據PrimeScriptTM OneStep RT-PCR Kit 試劑盒使用說明書進行RT-PCR擴增。具體反應體系如下：總RNA模板10 μL，5′-UTR-F 1 μL，5′-UTR-R 1 μL，PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 2 μL，2×1 Step Buffer 25 μL，RNase Free ddH2O 11 μL，總體積為50 μL。具體RT-PCR 反應條件如下：50 ℃ 30 min;94 ℃ 5 min，95 ℃ 35 s，56 ℃ 35 s，72 ℃ 30 s，共32個循環;72 ℃延伸10 min。最后，將RT-PCR擴增產物置于1.0%瓊脂糖凝膠中進行電泳，并觀察電泳結果。

1.7 目的基因的克隆與序列測定

收集凝膠電泳目的條帶，利用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒對目的片段進行純化，將純化后的目的基因與pMD18-T載體進行連接，并轉化至Escherichia? coli DH5α感受態細胞。對重組質粒進行培養，挑取白色菌落開展PCR鑒定。用高純質粒小量制備試劑盒提取重組質粒DNA，經酶切鑒定后將陽性重組質粒DNA送交北京鼎國生物科技有限公司進行測序。

2 結果與分析

2.1 RT-PCR 擴增結果 對RT-PCR 擴增產物進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果顯示12份疑似樣品中有1份樣品擴增出約267 bp的條帶，與預期的目的基因大小相符（圖1）。

2.2 核苷酸序列同源性比較

將獲得的目的基因測序結果與GenBank數據庫中的參考毒株進行BLAST比對分析，結果顯示測序基因序列屬于BVDV，命名為BVDV-YL1。將BVDV-YL1與19個參考株進行核苷酸同源性比較（圖2），結果顯示BVDV-YL1與中國新疆XJ04株和BVDV2-125C株核苷酸同源性分別為96.4%和96.0%，與 BVDV1參考株核苷酸同源性為37.6%～77.9%。測序結果表明，BVDV-YL1屬于BVDV2型毒株。

2.3 BVDV-YL1 基因遺傳進化樹分析

根據BVDV的5′-UTR 基因核苷酸序列同源性分析，構建BVDV-YL1遺傳進化樹（圖3）。結果顯示，BVDV-YL1毒株與中國新疆XJ04株和BVDV2-125C株親緣性較近，同屬BVDV2型。

3 討論

BVDV1型和BVDV2型的同源性約60%。其中，BVDV1可分為18個基因亞型（BVDV1a～BVDV1r）[4]，BVDV2 可分為BVDV2a、BVDV2b、BVDV2c和BVDV2d四種亞型[5]。基于RNA病毒具有較高的基因突變性，BVDV基因的更多新亞型將被發現。結果顯示，病毒的亞型與流行區域密切相關。比如，BVDV在歐洲主要以BVDV1a、BVDV1b、BVDV1d、BVDV1e、BVDV1f等多種亞型和BVDV2型為主[6]，在北美國家主要以BVDV1b和BVDV2a型為主，日本主要以BVDV1a型的形式存在[7]。在國內，1980年李佑民等[8]首次從流產的胎兒脾臟中分離到BVDV，經鑒定為1b亞型。目前，我國主要存在BVDV1a、BVDV1b、BVDV1c和BVDV2型。1991年劉崇向等[9]首次在羔羊腹瀉病料中檢測到BVDV。王青青等[10]在新疆南疆地區規模化奶牛場內檢測到BVDV1c的感染。蔡元慶等[11]在新疆石河子和伊犁地區對疑似患畜新鮮糞便檢測發現存在BVDV1感染。王龍等[12]采用RT-PCR方法從新疆16個不同地區的21份樣品中檢測到17株為BVDV1型，4株為BVDV2型。李娜等[13]在新疆石河子地區64份牛全血樣品進行BVDV檢測，發現全部樣品均為BVDV-1b感染。目前，相關研究人員已在新疆牛場中檢測到BVDV1b 、BVDV2、BVDV1c、BVDV1q、BVDV1f和BVDV1型未知亞型，從而證實了BVDV在新疆范圍內流行的多樣性和復雜性。

新疆是我國重要的畜牧業生產基地之一，規模化牛場分別較廣，BVDV的防控形勢也日趨嚴重。該試驗從伊犁河谷地區規模化牛場采集的12份疑似樣品中檢測出1份 BVDV 陽性樣品。基因分型鑒定結果表明，BVDV-YL1 株與中國新疆XJ04株和BVDV2-125C株親緣性較近，同屬BVDV2型，從而證實伊犁河谷地區規模化牛場中存在 BVDV2型的感染，為該地區牛病毒性腹瀉病的防控提供了重要的理論支撐。

參考文獻

[1] 殷震，劉景華.動物病毒學[M].2版.北京：科學出版社，1997.

[2] RIDPATH J F，BOLIN S R，DUBOVI E J.Segregation of bovine viral diarrhea virus into genotypes [J].Virology，1994，205（1）：66-74.

[3] OLAFSON P，MACCALLUM A D，FOX F H.An apparently new transmissible disease of cattle[J].Cornell Vet，1946，36：205-213.

[4] YE ILBAGˇ K，FRSTER C，OZGR OZYIGˇIT M，et al.Characterisation of bovine viral diarrhoea virus（BVDV）isolates from an outbreak with haemorrhagic enteritis and severe pneumonia[J].Vet Microbiol，2014，169（1/2）：42-49.

[5] GIANGASPERO M，HARASAWA R，WEBER L，et al.Genoepidemiological evaluation of bovine viral diarrhea virus 2 species based on secondary structures in the 5′ untranslated region[J].J Vet Med Sci，2008，70（6）：571-580.

[6] BECHER P，ORLICH M，SHANNON A D，et al.Phylogenetic analysis ot pestiviruses from domestic and wild ruminants[J].J Gen Virol，1997，78（Pt6）：1357-1366.

[7] TAJIMA M.The prevalent genotypes of bovine viral diarrhea virus in Japan，Germany and the United States of America[J].Jpn J Vet Res，2006，54（2/3）：129-134.

[8] 李佑民，劉振潤.吉林省某奶牛場暴發牛病毒性腹瀉-粘膜病及其病毒分離的初步研究[J].中國人民解放軍獸醫大學學報，1981，1（3）：62-64，70.

[9] 劉崇向，王治才，沙吾列.羔羊腹瀉病料牛病毒性腹瀉病病毒檢測[J].新疆農業科學，1991（6）：280-281.

[10] 王青青，張迎春，崔鑫，等.新疆南疆牛病毒性腹瀉病毒基因型鑒定及分析[J].畜牧與獸醫，2018，50（7）：113-117.

[11] 蔡元慶，雷程紅，包振中，等.新疆部分地區牛病毒性腹瀉-黏膜病病毒的分離鑒定[J].新疆農業科學，2015，52（12）：2335-2343.

[12] 王龍，梁霄勇，季新成，等.新疆部分地區牛病毒性腹瀉病毒的分離、鑒定及分子流行病學調查[J].新疆農業科學，2015，52（2）：334-338.

[13] 李娜，韓猛立，黃新，等.新疆石河子地區牛病毒性腹瀉病毒的分子流行病學調查[J].石河子大學學報（自然科學版），2009，27（6）：706-711.