適應性進化和改造質粒穩定性促進枯草芽孢桿菌合成N-乙酰神經氨酸

錢蕾,劉延峰,李江華,劉龍,堵國成

1(工業生物技術教育部重點實驗室(江南大學)，江蘇 無錫，214122)2(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122)

唾液酸(sialic acids，SA)是9碳氨基糖家族，目前發現大于40種形式源自神經氨酸[1]。在結構上，其2、4、5、7、8和9位上的各種類型的組合有助于SA的多樣性[2]。最常見的SA分子是N-乙酰神經氨酸(N-acetylneuraminic acid，NeuAc)，一種羧化的9碳單糖，5位上帶有N-乙酰基[3]。NeuAc在細菌和動物中無處不在，是人類SA的主要形式。此外，NeuAc在調節生物識別、細菌免疫和疾病方面具有重要作用[4]，并且是唾液酸化人乳寡糖重要單體之一，對改善嬰兒發育至關重要[5]。因此，NeuAc是一種具有較大市場需求的新型生物發酵產品。

提高NeuAc的發酵產量以及降低其生產成本一直是推動NeuAc在生物發酵領域被應用的重要前提。在過去的研究中，對NeuAc代謝途徑中的關鍵酶做理性改造以提高轉化效率[6]，但全細胞催化所需的底物昂貴增加了生產成本[7]。而且在微生物代謝改造中，通常利用較強的轉錄翻譯元件以加強產物途徑[8]，弱化[9]甚至敲除競爭途徑[10]，代謝流量大量用于產物合成從而導致細胞生長受損[11]。生物傳感器與適應性進化的組合策略能夠緩解這種平衡失調[12]，在應用選擇壓力時富集高產菌株[13]。進一步地，適應性進化對于穩定微生物表型以及分析進化過程中特定基因的變化情況是一種有效的辦法[14]。同時，基于質粒的基因表達系統是微生物代謝途徑改造的常用工具，然而質粒的不穩定往往降低了菌株產物合成效率[15]。

為了提升重組枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)合成NeuAc的產量以及解決發酵過程中重組枯草芽孢桿菌質粒丟失的問題，本文在前期研究的基礎上，利用已成功構建的NeuAc-Biosensor調控spc和erm抗性基因表達，實現細胞生長與產物產量偶聯，進而通過適應性進化提升NeuAc合成效率。同時通過將必需基因folB插入攜帶NeuAc合成途徑關鍵酶編碼基因重組質粒并且敲除基因組中的folB基因，有效降低了發酵過程中的質粒丟失率。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質粒

本實驗所使用的菌株及質粒如表1所示。目的基因擴增引物及敲除引物如表2所示。

表1 本研究中使用的質粒和菌株Table 1 Plasmids and strains used in this study

表2 本研究中使用的引物Table 1 Primers used in this study

1.1.2 酶與試劑

質粒提取試劑盒、DNA片段純化試劑盒、感受態制備試劑盒，生工生物工程(上海)有限股份公司；PrimeStar max聚合酶、限制性內切酶，TaKaRa。

1.1.3 培養基

LB培養基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 5，pH 7.0;發酵培養基(g/L)：酵母粉 12，胰蛋白胨 6，(NH4)2SO46，K2HPO4·3H2O 12，KH2PO42.5，MgSO4·7H2O 3，葡萄糖 60，尿素 6；枯草芽孢桿菌感受態培養基(均為質量分數)：SPI-A:0.4% (NH4)2SO4，2.8% K2HPO4·3H2O，1.2% KH2PO4，0.2% C6H5Na3O7·2H2O，SPI-B：0.04% MgSO4·7H2O。100×CAYE：2% 酪蛋白水解物，10% 酵母粉，100×EGTA∶10 mmol/L EGTA；SPI:980 μL SPI-A,980 μL SPI-B,20 μL 100×CAYE,20 μL 50%的葡萄糖溶液；SPII:2 mL SPI，20 μL 50 mmol/L CaCl2，20 μL 250 mmol/L MgCl2。

1.2 實驗方法

1.2.1 重組抗性質粒構建方法

以質粒p136為模板，分別以引物136-spc-F/R和136-erm-F/R進行擴增得到大小為8 744 bp的線性化質粒載體；以質粒p7s6為模板，引物spc-F1/R1和spc-F2/R2進行擴增得到大小為783 bp的spc基因；以質粒p7e6為模板，引物erm-F1/R1和erm-F2/R2進行擴增得到大小為738 bp的erm基因。將擴增得到的線性DNA片段回收純化后進行Gibson組裝[17]，并轉化至E.coliJM109進行質粒擴增,得到正確重組質粒p136-spc、p136-erm和p136-spc-erm。

1.2.2 質粒構建與基因敲除方法

以p43 NMK-AN為模板，引物p43-F/R進行擴增得到大小為9 094 bp的線性化質粒載體，以B.subtilis168基因組為模板，引物folB-F/R進行擴增得到大小為363 bp的folB基因。將擴增得到的線性DNA片段回收純化后進行Gibson組裝，并轉化至E.coliJM109進行質粒擴增。菌落PCR和測序驗證后，得到正確重組質粒p43-folB，進一步將質粒轉化菌株BS3C。然后對基因組上folB進行敲除[18]，以p7Z6質粒為模板，引物zeo-F/R為引物擴增得到大小為656 bp的zeo基因，以B.subtilis168基因組為模板，分別使用引物folB-L-F/R和folB-R-F/R擴增得到大小為944和1 022 bp左右同源臂，將擴增得到的線性DNA片段回收純化后以引物RH-folB-F/R進行PCR融合，將得到融合產物轉化上述菌株BS3C，選擇zeo轉化子后將pTSC引入，組成型表達的Cre重組酶介導lox71和lox66之間的重組，涂布于無抗性平板并在51 ℃下培養，消除了pTSC，從而獲得了目標菌株BS3B。

1.2.3 培養方法

24孔深孔板發酵：挑取單菌落接種至發酵培養基中，每孔培養基為1.5 mL，37 ℃、220 r/min培養50 h左右。上述培養基中加入相應篩選濃度的壯觀霉素和紅霉素。

1.2.4 感受態細胞制備

大腸桿菌感受態制備和轉化：參照上海生工大腸桿菌超級感受態細胞制備試劑盒說明書。

枯草感受態制備和轉化：挑取宿主菌接種于1支2 mL SPI 培養基中,于14 mL搖菌管中，37 ℃搖床培養過夜；取40 μL過夜培養的菌液，接種至用2 mL SPI 培養基中，37 ℃搖床培養5～6 h后，取200 μL接種到2 mL SPII 培養基中，37 ℃ 220 r/min培養1.5～2 h；加入20 μL 100×EGTA溶液，37 ℃ 220 r/min 搖床培養10 min，用1.5 mL離心管分裝成500 μL每管；加入適量的質粒0.5～1 μg，輕輕混勻，37 ℃ 220 r/min 培養1.5～2 h；以4 000 r/min 離心2 min收集菌體，棄部分上清液，留100 μL重懸菌體，涂布于相應的抗性平板，37 ℃過夜培養。

1.2.5 分析方法

假陽性率測定：將傳代結束之后的發酵液系列稀釋后涂布于抗性平板上，挑取平板上全部單菌落進行發酵驗證NeuAc產量，產量較出發菌株并未提高的計為假陽性細胞，計算得到假陽性率。

NeuAc濃度測定：通過HPLC測定分析產物濃度，色譜柱為Aminex HPX-87H柱(300 nm×7.8 nm)；流動相為10 mmol/L H2SO4溶液，流速為0.5 mL/min，NeuAc的保留時間為9.5 min。將發酵液8 000×g離心10 min后取上清液，用30 mmol/L H2SO4溶液處理混勻后過濾以測定濃度[19]。

質粒丟失率測定：將單菌落接種至100 mL液體LB培養基中，12 h后以10% 接種量接種至LB培養基中，連續培養3代，每12 h轉接1次。選擇3個培養時間，隨機挑取100個單菌落點板轉接至LB和卡納抗性平板，比較2種平板上菌落數，計算質粒丟失率。

上述實驗均設置了3組平行。

2 結果與分析

2.1 NeuAc-Biosensor調控spc和erm基因表達效果驗證

利用前期成功構建的NeuAc-Biosensor質粒p136來構建的重組質粒，調控抗性基因spc和erm表達。這里使用的NeuAc-Biosensor是基于自FadR/GntR家族的轉錄調控因子NanR所構建[8]。NeuAc-Biosensor由2個反向連接的啟動子組成，分別調控NanR基因和GFP基因，為了將熒光蛋白的表達與細胞內NeuAc聯系起來，在調控表達GFP基因的不同啟動子中插入NanR結合位點，從而形成動態開關，即當細胞內NeuAc濃度低時，NanR與啟動子中的結合位點結合，阻止RNA聚合酶與啟動子結合并抑制下游GFP基因轉錄；當細胞內NeuAc濃度高時，NanR的活性被NeuAc的變構調節所消除，使得啟動子與NanR結合得到釋放，啟動子與RNA聚合酶結合并正常開啟下游基因的轉錄[16]。考慮到產NeuAc宿主菌株中質粒帶有卡納霉素抗性基因，因此選取枯草芽孢桿菌中另外2種常用抗性基因作為調控靶基因，即壯觀霉素抗性基因spc和紅霉素抗性基因erm，利用NeuAc-Biosensor調控spc和erm表達，將胞內NeuAc濃度與壯觀霉素或紅霉素抗性相關聯。將PCR擴增后的spc基因和erm以及載體質粒通過Gibson組裝構建重組質粒，如圖2所示。然后將質粒p136-spc，p136-erm轉化入NeuAc產量不同的枯草芽孢桿菌中，分別為BS1(0.8 g/L)、BS2(1.5 g/L)、BS3(2.4 g/L)，將成功轉化的上述菌株挑取單菌落后進行24孔深孔板發酵，發酵培養時培養基內添加相應抗生素，以半抑制濃度來表征調控效果，結果如表3所示。

a-p136-spc重組質粒；b-p136-erm重組質粒；c-p136-spc-erm重組質粒圖1 重組抗性質粒圖Fig.1 Map of recombinant resistance plasmid

表3 不同NeuAc產量重組枯草芽孢桿菌生長的抗生素半抑制濃度 單位：mg/L

從表3可知，高產菌株能夠在較高抗生素濃度條件下生長，說明biosensor對于抗性基因有較好的調控效果。

2.2 基于適應性化的BS3菌株發酵產NeuAc

適應性進化對于提高微生物在相關培養基上的生長和抗應變能力很重要。通常，實驗室中常用的定向進化方法為分批培養-連續傳代，這種方法成本比較低并且可以通過深孔板等更小培養體積的設備進行大規模培養，物理化學因素也比較可控。因此在這里我們選擇分批培養-連續傳代培養方法。在之前的研究中，通過對2個關鍵前體N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)和磷酸烯醇式丙酮酸的供應途徑進行模塊途徑工程以及平衡NeuAc的生物合成和細胞生長，NeuAc產量達到2.18 g/L[10]。為了進一步提高NeuAc產量且平衡細胞生長，我們將生物傳感器與適應性進化結合，在進化過程中不斷提高抗生素濃度，使得高產細胞形成生長優勢，從而富集得到高產菌株。由2.1小節可知，NeuAc-biosensor對抗性基因的調控效果在菌株BS3中效果較顯著，因此以帶有單抗性和雙抗性的BS3菌株為出發菌株，抗生素的篩選濃度梯度如表4所示，對其進行適應性進化，孔板發酵每隔24 h以10%的接種量進行取樣及傳代，5次傳代之后結束發酵。前期研究發現，在進化過程中，小部分細胞在沒有指定代謝物產生的情況下也能存活[19]，這種“逃逸”是由于永久選擇敏感性的突變引起的[20-21]，因此我們使用了雙抗性標記篩選來減少這種假陽性者的存活。經過5輪進化篩選之后，我們對3種抗性篩選平板均選取了15個單菌落進行了發酵驗證，通過HPLC方法測定NeuAc濃度后發現壯觀霉素和紅霉素篩選分別有4個和5個菌落較出發菌株產量有提高，而雙抗性篩選則有8個菌落較出發菌株產量有所提高，不同菌株的產量如圖2所示。按照上述假陽性率測定方法得到單抗性篩選的假陽性率為73.3%(壯觀霉素)、66.7%(紅霉素)，而雙抗性篩選的假陽性率則為46.7%。通過單抗性標記與雙抗性標記篩選的對比實驗發現，雙重選擇能夠有效減少假陽性菌株，再次體現了雙抗性篩選策略的優勢，同時得到1株產量為(3.16±0.19)g/L的菌株BS3C，較出發菌株產量提高了31.7%。

表4 適應性進化抗生素篩選濃度表Table 4 Concentration of antibiotic for adaptive evolution screening

a-壯觀霉素篩選產量驗證；b-紅霉素篩選產量驗證；c-壯觀霉素和紅霉素篩選產量驗證圖2 適應性進化后NeuAc產量驗證Fig.2 NeuAc production verification after adaptive evolution

2.3 基于對必需基因folB的改造提高質粒穩定性

抗生素抗性是重組質粒常用的篩選標記，添加抗生素可以提供選擇壓力，抑制質粒丟失的細胞生長。然而，抗生素在培養過程的降解會造成選擇壓力失效。另外，抗生素的添加還增加了成本，可能在工業環境中污染最終產品。雖然染色體整合表達具有更高的穩定性，但在許多情況下，基因整合效率低和表達強度不足阻礙了染色體整合表達的應用[22]。為了在不使用抗生素的情況下實現對質粒的選擇和維持，我們敲除了枯草芽孢桿菌基因組中的必需基因folB(編碼二氫喋呤醛縮酶),同時在表達NeuAc合成途徑關鍵基因的質粒中插入必需基因folB，獲得BS3C菌株，使細胞中必需基因folB的表達依賴于質粒的存在和質粒中folB表達(圖3)。通過上述改造，質粒的丟失率由34.1%下降至11.8%，BS3C菌株NeuAc產量為(3.34±0.22)g/L，維持在穩定水平。上述結果說明，利用必需基因改造的方法可以有效的保證產NeuAc枯草芽孢桿菌中質粒的穩定性。

a-質粒穩定性改造策略；b-質粒穩定性改造后產量與質粒丟失率圖3 質粒穩定性改造Fig.3 Modification of plasmid stability

3 結論

NeuAc在食品和生物醫藥等領域具有廣泛的應用，代謝改造是提高重組枯草芽孢桿菌中NeuAc產量和降低生產成本的重要手段。本研究利用NeuAc-Biosensor調控抗生素抗性基因表達，進而通過增加抗生素濃度進行適應性進化，NeuAc合成效率提升了33.8%。進一步通過將必需基因folB插入攜帶NeuAc合成途徑關鍵基因重組質粒，并且敲除基因組中的folB基因，有效降低了發酵過程中的質粒丟失率。本研究提升了重組枯草芽孢桿菌合成NeuAc的產量和穩定性，為重組枯草芽孢桿菌發酵法生產NeuAc奠定了基礎。