物理法改善魚肉蛋白功能特性研究概述

姜昕，王錫昌，潘鳳濤，季中春，施文正*

1(上海海洋大學 食品學院，上海，201306)2(鹽城市怡美食品有限公司，江蘇 鹽城，224300)

魚類作為重要的水產食品原料，因其體內富含蛋白質、無機鹽以及不飽和脂肪酸等營養成分，而深受人們的重視。而魚肉作為魚類主要的食用部分，含有豐富的肌原纖維蛋白和肌漿蛋白，其溶解性、凝膠特性、乳化特性、起泡特性等功能特性是決定魚糜制品、水產功能飲料以及水產分解型調味品品質的重要因素。對魚肉蛋白進行改性處理，改善蛋白的功能特性，有利于提高魚肉蛋白利用率，實現魚肉蛋白高質化應用。

常見的動、植物蛋白改性方法按照原理可分為物理改性、化學改性、酶改性和基因工程[1]。其中，物理改性通過溫度變化、壓力差、機械力、電磁場、射線等作用形式，改變蛋白質的高級結構和分子間的聚集[2],相比于其他改性方法，物理改性操作便捷，對產品營養性能影響較小[1]。傳統的物理改性方法包括熱加工、凍融、擠壓等，但是改性效果一般、操作時間較長[3],而新興物理改性技術能克服傳統方法的不足，具有操作時間短、耗能低等優點。此外，消費者對新技術應用的開放性態度以及對食品質量的高要求，使其對創新型傳統食品有較高的支付意愿，這更利于新興物理改性技術的應用[4]。因此，新興物理改性方法在魚肉蛋白產品的加工中具有較好的應用前景。

目前，物理改性研究多集中在改性植物蛋白或改性乳蛋白方面，且已應用于面制品以及肉類加工產品，而魚肉蛋白改性仍處于研究中。因此，該文對魚肉蛋白的物理改性研究進行綜述，以期為魚類深加工產品的工藝優化、魚肉蛋白產品的研發、魚糜加工副產物資源有效利用和蛋白改性新方法的探索提供參考。

1 超聲波技術

1.1 改性機理

超聲波被定義為超過人類聽覺閾值(>16 kHz)的聲波，其中多選用低頻高強度超聲波(high intensity ultrasound，HIU)改變食物理化性質[5]。聲波產生空化效應和機械效應，破壞氫鍵和疏水鍵等非共價鍵，使蛋白質解聚[6],蛋白結構展開，暴露出結構內部的巰基和疏水基團,二級結構(α-螺旋、β-折疊、無規則卷曲)發生變化。除此之外，超聲波通過改變蛋白結構，增加蛋白間的靜電排斥作用，抑制肌球蛋白自組裝，利于提高蛋白質溶解度[7]。但進一步提高超聲強度或超聲時間，蛋白質分子會因疏水相互作用而發生聚集，相應的功能特性降低；凝膠結構的孔隙度增加，致使網狀結構中的水分子向外釋放。

超聲波會引起蛋白質分子質量的變化，隨著超聲強度以及超聲時間的增加，肌球蛋白重鏈會發生降解[7]；而在更高的超聲強度下，肌球蛋白含量減少更加明顯，降解蛋白在自由基的作用下發生氧化重排，產生大分子物質[8]。肌球蛋白可以影響蛋白凝膠的形成，但大分子物質的產生反而不利于蛋白膠凝。目前,很多研究認為超聲不會引起蛋白的降解或聚集，研究結果的不一致性可能與超聲強度、超聲頻率以及蛋白質種類等因素有關。超聲強度以及超聲頻率較高、或者超聲時間較長都可能導致蛋白質降解，使分子質量發生變化。動、植物蛋白改性一般選擇20 kHz單頻超聲波進行處理，空化沖擊力大，但空化氣泡數量較少，對蛋白結構處理不能達到均勻改性效果，可能使部分蛋白過度超聲而發生凝聚，而其他蛋白未受超聲影響。在鰱魚肌原纖維蛋白[9]、蛋清蛋白[10]、乳清蛋白[11]研究中發現，多頻超聲波空化強度高，可以縮短超聲處理時間，增強蛋白改性效果，但對改性的均勻性需要進一步研究。

超聲波具有較強的改性效果，但也有一定的局限性。首先，在非最佳超聲條件下，特別是經過高功率或長時間超聲，會導致水分子(H2O→H+·OH)分解形成高度活性自由基，增加破壞性氧化過程的發生[12]。海水魚的脂肪含量豐富，在自由基的作用下，會加速脂肪的氧化，影響魚糜凝膠制品的品質特性。其次，超聲波主要通過空化作用改變蛋白質結構，但實際蛋白所受空化強度不均勻，使得蛋白質的變化不一，從而影響對結果的分析。因此，對超聲技術的研究不能僅局限于超聲強度和超聲時間對蛋白的影響，更應關注均勻改性以使蛋白獲得更好的功能特性。

圖1 超聲波技術對蛋白的改性機制Fig.1 Mechanism of protein modification by ultrasound technology

1.2 功能特性的變化

溶解性是蛋白質的水合特性，蛋白質溶解度是指在水中的分散程度。肌原纖維蛋白通常在水溶液中溶解度很低，在較高濃度的鹽溶液(>0.3 mol/L)中才能溶出[13]。表1為應用低頻高強度超聲波改性魚肉蛋白的部分實例。通過測定蛋白溶解度探索蛋白的分散程度，也可通過測定蛋白粒徑、比表面積、濁度間接了解蛋白的溶解程度，而電位、表面疏水基團含量、巰基含量、內源性熒光強度以及二級結構變化可以解釋上述指標的變化。超聲波處理可以提高鹽溶性蛋白的溶解度，其改性原因可總結為以下4個因素：(1)蛋白質的構象發生改變，使親水基團暴露；(2)空化使蛋白凝聚體解聚，粒徑減少；(3)改變蛋白表面電位，阻礙蛋白質聚集；(4)經過超聲處理后，適當溫度升高有助于增加溶解度。但是要注意的是，如果蛋白質超聲處理時間過長，產熱過多會使蛋白質發生凝聚，不利于提高蛋白質溶解度。

凝膠特性的變化與蛋白結構改變以及蛋白質分子之間的相互作用有關[14]。凝膠特性的變化通過凝膠強度、質構特性、持水性、水分分布以及微觀結構等進行表征。經過超聲處理，肌原纖維蛋白以及肌球蛋白凝膠的凝膠特性也會發生相應的變化。在一定的超聲條件下，凝膠形成能力、持水性增加，微觀結構更緊密，固定化水含量增加，可知蛋白凝膠的凝膠特性增強與蛋白質粒徑、共價鍵以及疏水相互作用有關。

蛋白質乳化特性以及起泡特性主要與蛋白表面活性有關(表面疏水性、親水性、凈電荷或電荷分布等)，此外還受溶解性、離子強度、pH以及溫度的影響。乳化特性和起泡特性通常選用乳化活性指數和乳化穩定性、起泡能力和起泡穩定性進行評價。根據表1可知，在適當超聲條件下，空化作用以及機械作用減少蛋白分子尺寸并使蛋白分散均勻，使其乳化特性以及起泡特性增強。但在魷魚蛋白[15]以及大豆蛋白[16]的研究中發現超聲處理會降低起泡穩定性，其原因可能與蛋白黏度降低有關，黏度降低不利于空中網絡結構的形成，從而不利于起泡穩定性的增強。

表1 應用低頻高強度超聲波改性魚肉蛋白舉例Table 1 Examples of fish protein modified by HIU

2 超高壓技術

2.1 改性機理

超高壓(ultra-high pressure，UHP)技術是指在100 MPa以上的壓力條件下處理食品，從而改變其空間結構以及所含成分的生物活性[3]。經過UHP處理，蛋白發生變化：在較低壓力強度下，非共價鍵斷裂，蛋白解聚，粒徑降低[1]；蛋白結構共價鍵被破壞，結構展開，疏水基團暴露,蛋白表面電位發生改變；大量暴露的巰基氧化生成二硫鍵(壓強≥200 MPa)[24]；二級結構α-螺旋減少，蛋白由有序向無序轉變[25]。隨著壓力強度以及保壓時間增加，蛋白質受疏水相互作用和靜電相互作用發生凝聚,而當蛋白質處于更高壓力條件下，則會發生不可逆的變性。

UHP技術應用廣泛，在改性處理過程中一般不會促進脂肪氧化，但也有研究發現UHP會加快魚肉脂肪氧化，這可能與高強度壓力或長時間處理有關[26]。脂肪氧化過程中產生的中間產物會與蛋白質進一步反應形成更多的羰基和巰基，從而影響蛋白質的功能特性，但適當的氧化會提高蛋白的凝膠特性[27]。因此，在UHP處理過程中，針對不同原料應選擇適宜的壓力強度和保壓時間，控制環境溫度來避免蛋白功能特性降低。

2.2 功能特性的變化

UHP處理魚肉蛋白，其變性程度主要與壓力強度和保壓時間有關，表2為應用UHP改性魚肉蛋白的典型例子。不同壓力條件下蛋白溶解度變化不一,這是由于在適宜的處理條件下，加壓可以減小蛋白質粒徑，從而改變蛋白質溶解狀態，非適宜壓力強度和保壓時間下，蛋白質分子內部的疏水基團結構展開而數量增加，有利于蛋白質分子間疏水相互作用的產生，導致蛋白質凝聚，溶解度下降。因此，UHP技術雖然可以提高鹽溶性蛋白的溶解度，但如果反應強度過高會不利于控制蛋白的變化，基于蛋白結構的復雜性，改性處理條件還需要進一步研究。

超聲對凝膠特性及乳化特性的影響比較明顯，在適宜的壓力強度和保壓時間下，超聲對兩者均起到提高作用。疏水基團以及巰基的暴露，為疏水相互作用的產生和二硫鍵的形成提供了條件，而這有利于魚糜三維微觀結構的形成，提高蛋白的凝膠特性。乳化性與溶解度和表面疏水性有關，加壓減少了蛋白粒徑、暴露疏水基團，利于提高蛋白的乳化性，但隨著進一步加壓，蛋白聚集，疏水基團被包埋，乳化性降低。目前尚無UHP技術對魚肉蛋白質發泡性能影響的研究，但依據機理，蛋白質經過UHP處理，蛋白結構展開、溶解度增加，更利于提高蛋白的吸附率，改善蛋白質的發泡特性。

表2 應用超高壓改性魚肉蛋白Table 2 Examples of fish protein modified by UHP

3 微波技術

3.1 改性機理

微波是指頻率為300 MHz～300 GHz的電磁波，可以使食品中的極性分子在高頻電場作用下發生摩擦和碰撞，將磁場能轉化為熱能,使食品溫度升高，可作為滅菌、干燥和解凍的傳統方法[3]。在蛋白改性上，微波通過電磁和熱的作用使蛋白空間結構發生伸展、疏水基團暴露出來，產生分子間的相互作用，從而改變蛋白質空間構象，理化性質和功能特性也隨之發生改變[31]。對于肌球蛋白等極性分子，微波會影響蛋白質之間的靜電相互作用。但是進一步提高微波強度或者處理時間，功能特性會出現先增加后逐漸降低的趨勢。這是由于大量疏水基團的暴露使得蛋白質聚集，疏水基團內陷，表面疏水性降低。此外，在電場的作用下更容易形成二硫鍵，其表面疏水性高于水浴加熱后的蛋白質[32]。

3.2 功能特性的變化

微波處理魚肉蛋白，其強度大小會影響溶解度的變化。CAI等[33]發現高強度微波處理(300～900 W)草魚魚肉中的肌原纖維蛋白和肌漿蛋白溶解度均降低，這可能因為微波引起極性分子的旋轉和碰撞，壓縮了蛋白質表面親水殘基周圍的水化層，增加了蛋白質表面靜電相互作用；此外，隨著反應時間的延長，疏水基團暴露在蛋白質表面，表現出疏水相互作用，使蛋白聚集，致使溶解度降低。但在較低微波強度(100 W)條件下，蛋白經過微波處理粒徑降低，亞基數量增加，使得溶解度有所改善[34]。除此之外，由于電磁效應可通過破壞穩定的蛋白質-蛋白質結構，輔助其他改性技術提高蛋白溶解性。LI等[20]發現超聲與微波聯合(超聲300 W，微波100 W)不僅可以提高蛋白溶解度，還可以改善pH變化對蛋白溶解性的影響，使蛋白質在等電點附近仍可達到較高的溶解度。

通過微波處理可以提高蛋白的凝膠特性、乳化特性以及起泡特性。適當微波處理可以推動巰基氧化生成二硫鍵，促使蛋白質交聯、凝膠化的產生，提高魚糜凝膠的保水性和凝膠強度，使魚糜凝膠呈現致密的微觀三維網絡結構[35]。依據ZHENG等[34]對植物蛋白乳化性的探究，可以推測在較低微波強度下(50～100 W)，微波可以提高蛋白乳液的乳化能力、乳化穩定性和流動性，并且可以減少油滴尺寸，這是疏水基團暴露及二級結構變化導致的。同時，適量熱處理以及電磁作用促進蛋白展開，使表面疏水基團暴露，有利于提高蛋白起泡性。但也有人認為蛋白質通過非共價鍵形成更大聚集體，水-空氣界面膜的穩定性下降，起泡特性降低[36]。因此，微波改性對蛋白起泡特性的影響還需進一步研究。

4 輻照技術

4.1 改性機理

輻照通常作為減少微生物污染、延遲食品貨架期的非熱處理技術。目前，輻照技術常借助60Co放射性同位數衰變時產生的γ-射線，或是電子加速器產生的電子束進行蛋白改性。經過輻照改性，蛋白肽鏈在空間的排列更加舒展，暴露了部分包埋在蛋白分子內部的活性基團。繼續增加輻照劑量，輻照產生的自由基會加速蛋白質氧化，但適度氧化會促進交聯產生并會暴露更多的疏水基團，對魚肉蛋白的功能特性影響較小[37]。

輻照對蛋白質分子質量的變化仍存在爭議。部分學者發現，肌球蛋白在高劑量(6～9 kGy)的電子束以及γ-射線輻照下，肌球蛋白重鏈及肌動蛋白會發生交聯，形成較大分子質量的多聚體，肌球蛋白重鏈含量降低[38-39]。部分學者認為肌原纖維蛋白中的肌球蛋白易受高劑量(9 kGy)電子束輻照發生降解[40]，這可能是由于自由基氧化造成的，但電泳圖譜中并未出現小分子物質數量的增加。因此，高劑量輻照蛋白含量的變化仍需深入研究。

高輻照劑量可能會使氨基酸殘基發生氧化、斷裂，改變蛋白一級結構[14],在允許劑量范圍下輻照改性食品，其氨基酸含量無明顯變化，不會造成太大損失。此外，在對畜肉產品進行輻照處理時發現反式脂肪酸含量增加，但在草魚魚糜電子束輻照過程中，反式脂肪酸含量無顯著性變化(P>0.05)[41],可能是由蛋白來源的差異性導致的。因此，還需要嚴格控制輻照劑量和輻照時間，在提高蛋白的功能特性的同時，保證食品的安全性。

4.2 功能特性的變化

輻照處理可以提高肌原纖維蛋白的溶解度，且經過研究發現溶解度的增加與自由基促進蛋白降解也有一定關系,但是隨著輻照劑量的增加，肌漿蛋白的溶解度呈下降趨勢，這與蛋白構象的變化以及蛋白交聯和聚集有關[42]。此外，輻照還可以改善魚糜的凝膠特性。LIN等[38]對帶魚魚糜進行電子束輻照預處理，發現在7～9 kGy劑量下的凝膠表層結構致密，基本形成凝膠網絡；呂梁玉等[43]用電子束輻照梅魚魚糜，發現5 kGy輻照劑量下的魚糜所形成凝膠的持水性、質構等性能優于其他劑量組。蛋白結構的變化有利于交聯網絡的形成，使得凝膠特性有所改善[44]：輻照產生自由基促進二硫鍵的形成；蛋白結構展開，蛋白表現較高的疏水相互作用；α-螺旋結構含量降低、β-折疊增加。

由于輻照促使蛋白展開,表現出較高表面疏水性，可推測在適宜輻照劑量下可改善魚肉蛋白的乳化特性及起泡特性，這在大米蛋白[45]、芝麻籽蛋白[46]和豬肌原纖維蛋白[47]的研究中得到證實。此外，根據蛋白種類的不同，適宜的輻照劑量差異較大。但有研究認為輻照引起蛋白交聯降低了魚肌原纖維蛋白的乳化活性指標及乳化穩定性[39]。因此，在對蛋白功能特性進行研究的同時，還需要對蛋白內部結構進行解析，這樣才能更好解釋蛋白特性的變化。

5 低溫等離子體技術

5.1 改性機理

等離子體是由處于氣態的離子、自由基、自由電子和中性物質組成的部分電離混合物，具有極高的化學反應活性，在食品行業中多作為一種新興的殺菌方法進行應用，等離子體系統見圖2[48]。在低溫等離子體體系中，帶電粒子持續不斷地獲得能量，會與樣品發生碰撞和蝕刻，誘導蛋白結構由致密變松散，大量活性基團暴露[49],但氣態粒子仍能保持較低的溫度，因此可作為一種蛋白改性技術，改變蛋白的功能特性[50]。目前，食品領域中，低溫等離子體技術常用的放電方式有介質阻擋放電、輝光放電和電暈放電[51]。

圖2 等離子體系統原理圖Fig.2 Schematic diagram of plasma system注：1-等離子體真空室;2-電極;3-薄膜樣品;4-高壓探針;5-電源(0～15 kV，60 Hz);6-干式氣缸;7-并聯電阻(電流測量);8-真空計;9-示波器;10-機械真空泵;11-渦輪分子真空泵;12-真空計

5.2 功能特性的變化

等離子體技術可以改變蛋白質的凝膠特性。MIAO等[52]研究了等離子體對阿拉斯加狹鱈肌肉肌原纖維蛋白的理化特性的影響，發現等離子體技術(40 kV)可以增強肌原纖維蛋白凝膠性以及熱穩定性，使肌原纖維蛋白功能特性增強；隨著處理電壓的升高，游離巰基含量明顯降低，蛋白凝聚，肌原纖維蛋白的濁度和表面疏水性增加。

目前尚無等離子體技術對魚肉蛋白質溶解性、乳化特性、起泡特性影響的研究，但可依據其他蛋白的研究進行推測。適宜的低溫等離子體處理條件下，高能粒子轟擊蛋白質分子，使親水位點暴露結合大量水，提高蛋白溶解性；隨著進一步的轟擊，疏水基團的暴露有利于乳化性能和起泡性能的提高[49]。但也有研究認為溶解度隨處理時間增加而降低，且其原因歸結于疏水性基團的暴露[53]。結果的差異性可能與不同種類蛋白結構的差異性及蛋白內部活性基團所處位置有關，魚肉蛋白的研究可參考對蝦肌原纖維蛋白[53]。

作為一種新型技術，低溫等離子體技術在蛋白質改性,尤其是魚肉蛋白改性方面的研究較少，但目前研究認為低溫等離子體對商品化包裝魚片脂質的氧化指標、脂肪酸組成及營養質量無顯著影響(P>0.05)，但對較為敏感的魚肉蛋白還需要進一步探究[54]。

6 其他因素在改性過程中對蛋白的影響

6.1 離子強度

在物理改性過程中，除了技術處理條件對蛋白功能特性有一定影響，環境條件對其也有一定影響。離子強度對肌原纖維蛋白等鹽溶性蛋白影響較大。在魚肉蛋白改性過程中，通常添加NaCl來提高離子強度，促進鹽溶性蛋白溶出，增加蛋白質-蛋白質之間的相互作用，改善蛋白質溶解性、凝膠特性、乳化特征和起泡特性[55]；而在低鹽濃度下，蛋白不易展開、靜電斥力較弱，使得蛋白易發生凝聚，不利于蛋白產品的加工[56-57]。但隨著消費者對健康飲食的青睞，低鹽蛋白產品的開發是蛋白類食品研究的重要方向。

目前，可以降低魚肉制品中NaCl含量但仍能保證蛋白功能水平的方法有：蛋白質改性、鈉替代和添加活性肽。蛋白質改性技術可以促進蛋白結構展開，使更多的活性基團(親水基團、疏水基團、巰基等)暴露，從而改善低鹽環境下蛋白的功能特性。鈉替代是選擇CaCl2、KCl、MgCl2部分替代NaCl，在提高離子強度的同時，對蛋白結構也會有相應的影響，這種方法多輔助蛋白改性技術對蛋白進行處理。添加活性肽可以提高蛋白的凝膠特性[58]，但相比于前2種方法成本較高，不適于實際生產。

6.2 溫度

溫度會影響蛋白結構變化和產品品質。為了排除溫度對蛋白的消極影響，通常在0～4 ℃環境下存放蛋白或進行蛋白改性；但由于部分改性設備的局限性，使得溫度不能保持較低的恒溫狀態，如UHP改性過程中通常處于常溫條件下。在常溫環境中，魚肉的鹽溶性蛋白會隨著時間增加損失增大，且溫度越高損失率越大[59]。溫度對魚糜制品的凝膠形成能力也有一定的影響，ZHU等[60]發現阿拉斯加鱈魚魚糜在5 ℃UHP處理下的凝膠比25 ℃具有更強的凝膠強度，這可能是由于蛋白酶在不同溫度下對蛋白的影響所致。因此，在蛋白改性過程中需依據不同的改性目的控制溫度的變化、設定所需溫度。

6.3 pH

pH不僅可以影響蛋白表面電荷，還會影響蛋白質結構的變化。目前，蛋白改性過程中多借助pH偏移法輔助修飾蛋白，pH偏移法使處于極端pH條件下的蛋白質內部氫鍵斷裂、結構展開，隨著pH逐漸調節至中性后，蛋白可發生重新折疊[61]。相比于中性環境，蛋白疏水基團在酸堿條件下含量較高，且堿性環境下與中性相比巰基含量差異更大，這與蛋白結構的展開有關。此外，在酸性條件下蛋白巰基更易產生二硫鍵，而在堿性條件下二硫鍵容易發生斷裂，這可能與改性過程中產生的自由基有關，有研究表明在酸性情況下更易產生自由基，所以在酸堿環境下二硫鍵的含量有一定差異性[62-63]。因此，可通過調節pH來輔助蛋白改性，提高蛋白的功能特性。

不同改性技術在處理過程中也會對蛋白樣品pH產生影響。如蛋白溶液經過超聲處理后pH增加、經過長時間低溫等離子體技術pH會降低,但是多數改性過程時間短、強度低，對pH影響不顯著(P>0.05)。

7 展望

蛋白質改性的應用前景十分廣闊，而物理改性相比于其他改性方法更溫和、無污染，對產品營養性能影響較小，更適用于蛋白加工生產。但是魚肉蛋白物理改性研究仍還存在一些問題值得進一步思考：(1)目前蛋白改性研究多以技術為主題，探索蛋白的不同功能特性變化，但以實際生產為目的，需要從蛋白功能特性角度出發，選擇適宜物理改性方法，并探索實施應用的可能性;(2)對于不同魚肉原料，其營養成分差異性大，部分技術的化學效應會影響脂肪以及蛋白的變化，可能對功能特性起到提升/降低的作用,因此，在探究改性蛋白特性的同時，也需要對其他營養成分的變化進行探討，以確保魚類加工產品品質;(3)利用不同改性原理，將物理改性方法與化學方法或酶法聯用，能更好地實現對蛋白功能特性的修飾，但聯合改性技術中不可控因素較多且步驟繁瑣，因此還需要對其改性效果和投入成本進行比較;(4)目前物理改性蛋白研究多局限于植物蛋白和乳清蛋白，很多新興物理改性技術，如超臨界流體擠壓、機械旋磨活化技術，對魚肉蛋白功能特性的影響還有待進一步研究。