紅棗多糖超聲波提取、結構表征及抗氧化活性評價

楊燕敏，鄭振佳，高琳，張硯壘，張仁堂

(山東農業大學 食品科學與工程學院，山東省高校食品加工技術與質量控制重點實驗室，山東 泰安, 271018)

紅棗(ZiziphusjujubaMill.)，又名大棗、棗子、中華大棗，有“維生素王”之稱，是鼠李科棗屬植物棗樹的果實[1]。紅棗是藥食同源品種，富含維生素、多糖、蛋白質、有機酸、黃酮和環磷酸腺苷等營養物質，具有補中益氣、養血安神、治療脾虛食少與婦人臟躁等病癥的功效[2]。

多糖是紅棗中一種重要的生物活性物質，研究表明紅棗多糖具有抗氧化[3]、抗腫瘤[4]、保肝[5]和降血脂[6]等多種生物活性。超聲波輔助提取具有提取時間短、操作簡單、成本低及提取率高等優點[7]，廣泛應用于植物功能組分的提取中。紅棗多糖的抗氧化活性主要集中于體外抗氧化評價，體內抗氧化評價研究較少，斑馬魚與人體器官在分子水平、生理結構等方面非常相似[8]，其模型能夠反映活性成分的體內抗氧化效果。本實驗以新疆哈密大棗為研究對象，采用響應面優化超聲波輔助提取多糖，并研究了多糖的結構表征、體外以及斑馬魚體內抗氧化活性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新疆哈密大棗，泰安棗批發市場；皮膚熒光轉基因斑馬魚，山東省科學院生物研究所斑馬魚藥物篩選平臺。

濃硫酸，優級純，濟南試劑總廠；苯酚、石油醚、無水乙醇、葡萄糖，分析純，天津市凱通化學試劑有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)，分析純，上海華藍化學科技有限公司；2,2′-聯氮基雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)，分析純，合肥博美生物科技有限公司；正丁醇，分析純，天津市大茂化學試劑廠；單糖標準品(鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、木糖、果糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸)，色譜純，上海源葉生物科技有限公司；甲硝唑、維生素C，分析純，上海生物化工公司；鏈霉蛋白酶、氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽，分析純，美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

754 N紫外可見分光光度計，上海奧普勒儀器有限公司；UV—2450紫外可見分光光度計，日本島津公司；KQ500DE型數控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；高效陰離子交換色譜儀、Nicole iS10型紅外光譜儀，美國Thermo Fisher Scientific科技公司；X51型倒置顯微鏡，日本Olympus公司；Forma 3111型水套式CO2培養箱，美國Forma公司；斑馬魚養殖飼養設備，北京愛生科技公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 紅棗多糖的提取

紅棗去核切片→干燥粉碎、過40目篩→超聲提取紅棗多糖→離心取上清液→加入4倍體積無水乙醇醇沉過夜→離心取沉淀定容→苯酚硫酸法測多糖含量

1.3.1.1 單因素試驗

以1.0 g棗粉為基準，固定提取溫度60 ℃，超聲時間30 min，超聲功率300 W，研究不同液料比10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1 (mL∶g)對紅棗多糖提取率的影響；固定液料比20∶1 (mL∶g)，超聲時間30 min，超聲功率300 W，研究不同提取溫度40、50、60、70、80 ℃對紅棗多糖提取率的影響；固定液料比20∶1(mL∶g)，提取溫度60 ℃，超聲功率300 W，研究不同超聲時間10、20、30、40、50 min對紅棗多糖提取率的影響；固定液料比20∶1 (mL∶g)、提取溫度60 ℃、超聲時間30 min，研究不同超聲功率100、200、300、400、500 W對紅棗多糖提取率的影響。

1.3.1.2 響應面優化設計

在單因素試驗的基礎上，固定超聲功率200 W，確定超聲溫度、液料比以及超聲時間的3因素3水平。利用Design-Expert 8.0.6 軟件Box-Behnken 法設計優化試驗，以多糖提取率為響應值，研究提取紅棗多糖的最優工藝參數。響應面水平如表1所示。

表1 響應面試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface experiment

1.3.2 紅棗多糖分離純化

將最優條件得到的多糖樣品進行石油醚脫脂，用石油醚和粗多糖溶液按1∶1體積比充分混勻，用分液漏斗分離，重復3次脫脂；Sevage法脫蛋白[9]；通過透析去除小分子雜質，濃縮后冷凍干燥多糖組分，用于后續實驗。

1.3.3 指標測定

采用苯酚硫酸法測定紅棗多糖含量[10]，回歸方程為：y=0.011x+ 0.0064，R2=0.9997。采用考馬斯亮藍法對紅棗多糖蛋白質含量進行測定[11]，回歸方程為：y=8.1243x+0.0423，R2=0.9911。

1.3.4 單糖組成

在80 ℃下,10 mg多糖用4 mL 2.0 mol/L的三氟乙酸(trifluoroacetic acid,TFA)水解6 h，通過N2沖洗除去溶液中殘留的TFA，然后溶于10 mL超純水中并通過SPE管和0.22 μm 超濾管進行澄清。使用PA10 IC色譜柱在30 ℃下以0.20 moL/L NaOH溶液作為流動相,0.25 mL/min的流速分析樣品。

1.3.5 光譜分析

1.3.5.1 紫外光譜分析

將多糖溶液在190～400 nm波段下進行掃描，分析掃描圖譜，觀察有無核酸吸收峰(260 nm)和蛋白質吸收峰(280 nm)，檢測雜質是否去除干凈[12]。

1.3.5.2 紅外光譜分析

取適量干燥的多糖樣品使用傅立葉紅外光譜分析(Fourier transform infrared spectroscopy，FT-IR)在4 000～400 cm-1范圍內掃描，使用OMNIC軟件分析結果[13]。

1.3.6 剛果紅染色

取1 mL 1 mg/mL紅棗多糖溶液、2 mL 60 μmol/L剛果紅溶液及1 mL不同濃度的NaOH溶液，靜置15 min后觀察不同濃度的NaOH溶液中多糖最大吸收波長的遷移情況[14]。

1.3.7 抗氧化

1.3.7.1 體外抗氧化

總還原力的測定，參照LIN等[15]的方法；DPPH自由基清除能力測定，參照許海順等[16]的方法；ABTS陽離子自由基清除能力的測定，參照胡治遠等[17]的方法。

1.3.7.2 斑馬魚模型的抗氧化作用

發育24 h的皮膚熒光斑馬魚，使用鏈霉蛋白酶脫去其胚胎外層的卵膜后隨機分成空白對照組(NC)、5 mmol/L甲硝唑造模組(MC)、陽性對照組(5 mmol/L甲硝唑+100 μg/mL Vc)(PC)、1 μg/mL紅棗多糖組(I)和25 μg/mL紅棗多糖組(II)，在熒光顯微鏡下觀察拍照。使用Imagepro-plus軟件統計斑馬魚的皮膚熒光點數量，并利用GraphPad軟件對數據進行統計分析，評估樣品的抗氧化活性。

1.3.8 統計學分析

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

超聲功率對多糖提取率的影響如圖1-a所示，功率100～200 W時，多糖提取率升高，當超聲功率繼續加大時，多糖提取率反而下降，由于超聲功率增大有助于細胞壁的破碎和液固兩相的相互混合，多糖提取率增大，但功率過強時，超聲波空化作用加大，多糖糖苷鍵可能遭到破壞，影響多糖提取率[18]。因此超聲功率以200 W為宜。超聲溫度對多糖提取率的影響如圖1-b所示，40～50 ℃時，溫度升高多糖提取率升高。溫度低時，分子運動慢使得多糖無法充分溶出，隨溫度升高，分子運動加快，多糖提取率升高。但是溫度升高到50 ℃以上時，隨溫度升高多糖提取率反而降低，這可能因為溫度升高影響多糖穩定性，多糖糖鏈降解，多糖提取率降低[19]。因此，適宜紅棗多糖提取的溫度為50 ℃。超聲時間對多糖提取率的影響如圖1-c所示，提取時間在10～20 min時，時間越長提取率越大，20 min時達到最大值。繼續延長提取時間，多糖提取率反而降低，因為提取前期細胞不斷破碎，使多糖溶出、得率增大，當超聲時間繼續延長，會導致多糖降解，使多糖得率降低[20]。因此，最適宜的超聲時間為20 min。液料比對多糖提取率的影響如圖1-d所示，當液料比從10∶1 (mL∶g)增加到15∶1 (mL∶g)時，溶劑較少，不利于多糖擴散。隨液料比增大，多糖提取率升高，在液料比15∶1時達到最大值。隨后提取率降低，隨著溶劑增加，多糖盡可能游離到溶液中，但溶劑量過大，大量雜質也會溶出，擠占多糖空間，導致提取率不升反降[21]。因此，最適宜的液料比為15∶1。

圖1 單因素對多糖提取率的影響Fig.1 Effect of single factor on the extraction rate of polysaccharides

2.2 提取工藝條件的優化

2.2.1 模型方程建立與顯著性實驗

在單因素試驗結果基礎上，以超聲溫度(A)、液料比(B)和超聲時間(C)為自變量，以紅棗多糖得率(Y)為響應值，利用Design-Expert 8.0.6設計3因素3水平試驗，得到的響應面分析結果如表2所示，得到回歸方程Y=3.06-0.11A+0.15B+0.070C+0.027AB-0.14AC+0.068BC-0.40A2-0.29B2-0.17C2。

回歸模型的方差分析結果如表3所示，模型P為0.000 1，說明該回歸模型極顯著，失擬項P=0.068 2>0.05，R2=0.972 5，表明該模型實驗誤差小，可利用該方程分析及預測紅棗多糖提取率隨相關因素變化的波動情況。

表2 Box-Behnken試驗設計與結果Table 2 Box-Behnken design and results

從表3中回歸系數的顯著性檢驗可知，回歸模型二次項中的A、B、A2、B2、C2(P<0.01)達到極顯著水平，C和AC達到顯著水平(P<0.05)，AB與BC不顯著(P>0.05)。B液料比對多糖提取率影響最大，其次是A超聲溫度，C超聲時間對多糖提取率影響最小。

表3 回歸方程的方差分析Table 3 Analysis of variance of regression model

2.2.2 響應面交互作用影響結果

響應面圖以及等高線圖可以直觀地反映兩兩因素間的交互作用。響應面圖越陡峭說明2個自變量間的交互作用對響應值影響程度越大，相反，越平緩交互作用影響越不顯著[22]。等高線圖越偏離圓形交互影響越強，反之，越接近圓形交互影響越弱。由圖2 分析得出，AC響應面3D圖陡峭，且等高線圖呈明顯的橢圓形，交互作用顯著，AB與BC等高線圖接近圓形，表明交互作用不顯著(P>0.05)，這與方差結果一致。

2.2.3 最優條件的確定與回歸模型的驗證

通過試驗分析，超聲輔助提取紅棗多糖最優工藝參數為超聲功率200 W、超聲溫度48.05 ℃、液料比16.49∶1 (mL∶g)、超聲時間23.52 min，多糖最優得率為3.11%，高于方元等[23]超聲波提取哈密大棗多糖的得率。考慮到實際操作的方便性，將提取條件調整為：超聲功率200 W、超聲溫度48 ℃、液料比16∶1(mL∶g)、超聲時間24 min，此工藝條件下進行超聲波輔助法提取紅棗多糖，試驗重復3次取平均值，得率為3.09%。實際測定值與預測值誤差較小，表明優化后的紅棗多糖提取工藝條件準確可靠。

圖2 各因素交互作用對多糖得率影響的響應面圖Fig.2 Response surface plots showing the interactive effects of various factors on polysaccharide yield

2.3 指標測定

經測定，紅棗多糖總糖含量為(50.98±1.26)%、蛋白質含量為(1.26±0.08)%。

2.4 單糖組成

紅棗多糖單糖組成的高效陰離子交換色譜如圖3所示。根據出峰時間和峰面積可以推斷紅棗多糖的單糖組成和比例，其單糖組成主要為阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、果糖以及半乳糖醛酸，比例為45.90∶19.72∶19.88∶3.03∶10.37∶1.10。

圖3 基于HPAEC-PAD的標準品和紅棗多糖的單糖譜Fig.3 Monosaccharide profiles of jujube polysaccharide based on HPAEC-PAD standards

2.5 光譜分析

2.5.1 紫外光譜分析

由圖4可知，在280 nm波長處有弱吸收峰，表明其含有蛋白質，與蛋白質含量測定結果相符合。

圖4 紅棗多糖的紫外掃描圖譜Fig.4 UV spectrum of jujube polysaccharide

2.5.2 傅里葉紅外變換光譜分析

圖5 紅棗多糖的紅外圖譜Fig.5 FT-IR spectrum of jujube polysaccharide

2.6 剛果紅實驗

由圖6可以看出，隨著NaOH溶液濃度從0增大到0.5 mol/L，紅棗多糖與剛果紅試劑作用產生絡合物的最大吸收波長呈現逐漸減小的趨勢，最大吸收波長的連續下降可能是因為多糖在水溶液中為無規卷曲構象，且越來越多的氫鍵被堿性溶液破壞[28]，可以判斷該紅棗多糖不具備三螺旋結構。

圖6 不同NaOH濃度下多糖與剛果紅絡合物最大吸收波長Fig 6 Maximum absorption wavelength of Congo red and Congo red-polysaccharides at various concentrations of NaOH

2.7 抗氧化實驗

2.7.1 體外抗氧化能力

由圖7可知，隨紅棗多糖濃度的增大，對DPPH自由基和ABTS陽離子自由基的清除能力逐漸升高后趨于穩定，呈一定的劑量關系。當多糖質量濃度達到1 mg/mL時，DPPH自由基清除率可達89%，其IC50為0.365 mg/mL；ABTS陽離子自由基清除率可達99%，其IC50為0.272 mg/mL。在0～1 mg/mL范圍內，總還原能力隨多糖濃度增大而增大，當多糖質量濃度為1 mg/mL時，其吸光度可達0.764。

圖7 紅棗多糖的體外抗氧化Fig.7 In vitro antioxidant activity of jujube polysaccharides

實驗結果表明紅棗多糖具有一定體外抗氧化能力。

2.7.2 斑馬魚抗氧化模型

從圖8可知，與空白對照組相比，經甲硝唑處理的模型組皮膚熒光數量極顯著降低(P<0.001)，Vc和紅棗多糖能夠有效緩解這種氧化損傷。與甲硝唑組相比，紅棗多糖在1和25 μg/mL下均具有抗氧化活性，尤其25 μg/mL的紅棗多糖皮膚熒光數量極顯著增加(P<0.001)，是100 μg/mL Vc的1.65倍。結果表明，紅棗多糖可以減輕甲硝唑對斑馬魚模型的氧化損傷。

圖8 紅棗多糖對甲硝唑誘導的斑馬魚氧化損傷模型的保護作用Fig.8 Protective effect of jujube polysaccharides on the zebrafish oxidative damage model induced by metronidazole

3 結論

本實驗在單因素試驗的基礎上，通過Box-Behnken響應面試驗設計優化得到了超聲輔助提取紅棗多糖工藝參數，在此條件下紅棗多糖得率為(3.11±0.15)%。光譜分析和剛果紅結果表明紅棗多糖為α-糖苷鍵的吡喃型糖苷環骨架，不含三螺旋結構，含少量蛋白質。主要的單糖組成成分為阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、果糖以及半乳糖醛酸等。體外抗氧化活性評價與斑馬魚抗氧化損傷模型共同證明了紅棗多糖具有較強的抗氧化活性。該研究為紅棗多糖進一步分離純化、結構解析、生物活性的研究以及開發具有潛力的功能性食品提供依據。