藍點馬鮫魚分離蛋白抗凍劑的復配

樊震宇，韓昕苑，余婷婷，張龍，王錫昌

(上海海洋大學 食品學院，上海，201306)

冷凍貯藏是水產品的主要貯藏方式，但在其貯藏、運輸、加工過程中經常會發生凍融循環(冷凍-解凍-冷凍)。由于分離蛋白中蛋白質已經發生變性，使分離蛋白極度不穩定，凍融循環后增加了蛋白質的氧化程度，降低了其持水性[1]，使分離蛋白的品質較大程度地降低,因此提高分離蛋白的抗凍性對低值蛋白高值化有非常重要的意義。而商業抗凍劑(4.0%蔗糖、4.0%山梨醇、0.3%多聚磷酸鹽)會引入較多的糖，導致蛋白甜味增加，從而影響口感，同時可能會減少適用人群。因此尋找一種不含熱量又具有較高抗氧化活性新型的抗凍劑成為水產品貯藏過程中重要的問題。

魔芋多糖(konjac glucomannan,KGM)不易被機體消化吸收，不含熱量并能減少和延緩葡萄糖的吸收，具有良好的乳化性、吸水性、穩定性、成膜性及凝膠形成能力，是一種良好的食品添加劑。較多研究表明，魚蛋白水解產物是一種有效的抗凍劑，例如LIMPISOPHON等[2]研究顯示，藍鯊魚皮水解90 min的酶解產物能有效抑制鱈魚魚糜的冷凍變性；DEY等[3]研究表明，斑節對蝦下腳料水解產物通過抑制蛋白冷凍變性，延緩叫姑魚魚糜的凝膠劣化；KITTIPHATTANABAWON等[4]研究表明，水解產物可替代傳統抗凍劑，并在魚糜產品中產生較低的甜味。因此本研究把藍點馬鮫魚分離蛋白酶解產物和魔芋精粉進行復配，以藍點馬鮫魚分離蛋白為研究對象，與商業抗凍劑(4.0%蔗糖、4.0%山梨醇、0.3%多聚磷酸鹽)進行對比，通過循環凍融對分離蛋白保水性和蛋白氧化變性程度的影響評價其抗凍效果。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

藍點馬鮫魚(Scomberomorusniphonius)，2017年10月購于上海市臨港新城蘆潮港海鮮市場，冰鮮運輸至實驗室，立刻去頭、內臟和鰭，采肉后于-40 ℃冷藏備用。分離蛋白制備與漂洗魚糜采用本課題前期研究方法制備[5]。

酶解產物溶液制備：以藍點馬鮫魚分離蛋白為底物，堿性蛋白酶酶解2 h，風味蛋白酶酶解2 h得到藍點馬鮫魚分離蛋白酶解液，將酶解液冷凍干燥后，用超純水定量配制為質量濃度10、20、30、40、50、60 mg/mL的酶解產物溶液，4 ℃貯藏備用。

白魔芋粉，強森魔芋有限公司；羰基試劑盒(貨號：BC1275)、總巰基試劑盒(貨號：BC1375),Solarbio。

1.2 主要儀器

SAF-680T酶標分析儀，上海巴玖實業有限公司；PQ 001型臺式脈沖核磁共振分析儀，上海紐邁電子科技有限公司；TA-XT Plus型質構儀，英國Stable Micro System 公司；FE20型pH計，上海梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 質構分析

將不同添加質量分數(0.3%、0.4%、0.5%、0.6%)魔芋加入分離蛋白中，在水浴條件下進行擂潰3 min，置于密封針管中，40 ℃水浴加熱20 min，然后在95 ℃水浴加熱20 min，取出凝膠冷卻至室溫后，在4 ℃冰箱中過夜，備用。

凝膠強度：將魚糜凝膠切成直徑10 mm、高10 mm的圓柱體，在室溫條件下平衡30 min，測定凝膠的硬度、彈性。

參數設置：參考馬海建等[6]的方法略加修改，測前速度2 mm/s，測試速度1 mm/s，測后速度1 mm/s，下壓距離50%，觸發力5 g，探頭型號選擇P/50。

1.3.2 持水力測定

將魚糜凝膠切成直徑10 mm、高10 mm的圓柱體，質量記為m1，用雙層濾紙包裹后置于50 mL離心管中,于4 ℃下冷凍離心10 min(5 000 r/min)，取出凝膠質量記為m2[7]，持水力按公式(1)計算:

(1)

1.3.3 抗氧化分析

DPPH自由基清除率測定：參考FLOEGEL等[8]的方法稍加修改，取1 mg DPPH溶于約20 mL無水乙醇中，超聲5 min后搖勻，在519 nm處測定吸光值，記為A，使A在1.2～1.3，避光備用(3.5 h內用完)。

取2 mL DPPH溶液加入5 mL棕色離心管中，加入1 mL不同濃度的酶解產物溶液，混勻后避光反應30 min，取200 μL該溶液加入96孔板中，在519 nm處測定吸光值,DPPH自由基清除率按公式(2)計算:

(2)

式中:A0,超純水代替樣品測定的吸光值；A1,樣品測定的吸光值；A2,乙醇代替 DPPH 溶液測定的吸光值。

ABTS陽離子自由基清除率：取3 mg ABTS溶于約0.735 mL超純水中，混勻后取0.4 mL該溶液與相同體積的K2S2O8(2.6 nmol/L)混合，反應12 h(黑暗、室溫)，再稀釋40～50倍，直到在734 nm的吸光值為(0.7±0.02)，避光備用。

取1 mL ABTS溶液加入10 μL不同濃度的酶解產物溶液，振蕩混勻后避光反應6 min，在734 nm處測定吸光值,ABTS+自由基清除率按公式(3)計算：

(3)

式中：A1,樣品測定的吸光值；A0,超純水代替樣品測定的吸光值。

1.3.4 凍融循環處理

將制備好的樣品分成4組，每組包括6個1 cm×1 cm×0.5 cm、4個3 cm×3 cm×0.5 cm分離蛋白樣品，在-20 ℃下進行冷凍貯藏，4 ℃解凍12 h，放回-20 ℃下進行冷凍貯藏，作為1次凍融。7 d循環1次，重復上述步驟，進行第2次、第3次凍融[1]。

1.3.5 解凍損失

參考XIA等[9]的方法，將1 cm×1 cm×0.5 cm樣品在未解凍前稱質量，記為m3，解凍后用濾紙吸取表面水分，稱質量，記為m4，按公式(4)計算解凍損失：

(4)

1.3.6 蒸煮損失

參考劉廣娟等[10]的方法，將1 cm×1 cm×0.5 cm樣品在解凍后稱質量，記為m5，用聚乙烯包裝袋密封后100 ℃蒸制 3 min,再冰浴2 min，4 ℃冷卻10 min，擦拭表面水分稱質量，記為m6，按公式(5)計算蒸煮損失：

(5)

1.3.7 水分分布

參考譚明堂等[11]的方法，并稍加修改。測定條件：質子共振頻率18.169 MHz，磁體強度0.43 T，磁體溫度32 ℃。測量參數：T值(90°脈沖與180°脈沖之間的時間)200 s，重復采樣間隔為2 000 ms,累加次數4次。得到8 000個回波，反演后得到結合水、不易流動水和自由水的相對百分含量。

1.3.8 羰基含量

利用羰基試劑盒測定肌原纖維蛋白羰基含量。

1.3.9 巰基含量

利用總巰基試劑盒測定肌原纖維蛋白巰基含量。

1.3.10 數據分析

數據由Excel、SPSS 20.0 進行分析，結果以平均值±標準偏差表示，n=3。

2 結果與分析

2.1 魔芋對分離蛋白凝膠特性的影響

不同魔芋添加量的分離蛋白凝膠特性分析結果如表1所示。分離蛋白的硬度、彈性、白度、持水力隨著魔芋添加量的增加而增大。這與黃莉等[12]的研究結論一致，當魔芋添加量(質量分數，下同)在0.4%時，與添加量為0、0.3%相比，硬度、彈性、白度、持水力均具有顯著性差異(P<0.05)，但硬度、彈性、白度隨添加量從0.4%增加0.6%不會出現顯著性地增長(P>0.05)。持水力結果顯示，當魔芋添加量從0.4%增加0.5%時，會顯著提升分離蛋白的持水力，因此選擇魔芋添加量為0.5%，使分離蛋白凝膠具有較好的凝膠特性。

表1 不同魔芋添加量的分離蛋白凝膠特性Table 1 Gel properties of protein isolates with different konjac additions

2.2 分離蛋白酶解物的抗氧化分析

以堿性蛋白酶酶解90 min 后再采用風味蛋白酶酶解90 min的藍點馬鮫魚分離蛋白酶解物為原料，研究不同質量濃度(10、20、30、40、50、60 mg/mL)的抗氧化能力，以DPPH自由基、ABTS陽離子自由基的清除率來表示，結果如圖1所示。隨酶解物濃度的增加，DPPH、ABTS陽離子自由基的清除率也呈現增加的趨勢，當質量濃度從30 mg/mL增加到40 mg/mL時，DPPH自由基清除率曲線具有最大斜率，質量濃度從40 mg/mL增加到60 mg/mL時，DPPH自由基清除率增加不明顯，因此選擇分離蛋白酶解物質量濃度40 mg/mL作為分離蛋白抗凍劑的添加量，與0.5%魔芋復配后與商業抗凍劑進行比較，研究其抗凍效果。

圖1 不同質量濃度的分離蛋白酶解物抗氧化特性Fig.1 Antioxidant properties of different concentrations of fish protein isolate hydrolysates

2.3 分離蛋白抗凍性研究

2.3.1 解凍損失和蒸煮損失

保水性 (water holding capacity，WHC) 是評價肉質的重要指標之一，保水性的高低會直接影響凝膠的風味、質構等[13]。本實驗利用解凍損失和蒸煮損失探究不同抗凍劑在反復凍融條件下對分離蛋白保水性的影響。復配組與商業抗凍劑組的實驗結果如圖2、圖3。

圖2 反復凍融對分離蛋白解凍損失的影響Fig.2 Effect of freeze-thaw cycles on thawing loss of fish protein isolates注:Y-分離蛋白；S-商業抗凍劑；E-復配組;圖中不同字母表示有顯著性差異(P<0.05)下同

圖3 反復凍融對分離蛋白蒸煮損失的影響Fig.3 Effect of freeze-thaw cycles on cooking loss of fish protein isolates

解凍損失結果顯示，分離蛋白組隨著凍融循環次數的增多，解凍損失呈現增加的趨勢，且有顯著性差異(P<0.05)，可能是由于反復凍融,分離蛋白中冰晶的變化和脫水縮合對蛋白質天然纖維結構造成不可逆的機械損傷，影響蛋白質的復水能力，因而使分離蛋白無法更好地存留更多的自由水[14]。而復配組與商業抗凍劑組在3次凍融中,解凍損失沒有顯著性差異(P>0.05)，由于這2種抗凍劑中帶有較多的親水基團，會抑制巨大冰晶體的形成,減少分離蛋白的開鏈變性，使其可吸附更多的水分[15]。

蒸煮損失結果與解凍損失一致，復配組與商業抗凍劑組在3次凍融中蒸煮損失沒有顯著性差異(P>0.05)，3組實驗中，蒸煮損失率由高到低依次為分離蛋白>商業抗凍劑>復配組，且每組之間有顯著性差異(P<0.05)，蒸煮損失越大，說明該組凝膠中含水量越小，直接影響分離蛋白凝膠后的質構特性[16]。雖然商業抗凍劑的解凍損失與分離蛋白在第2、3次凍融后無顯著差異，但其蒸煮損失低于分離蛋白組，且有顯著差異(P<0.05)，可能是由于分離蛋白組在解凍過程中空間結構變化較大，從而導致蒸煮后肌肉持水力降低[17]。綜上，在反復凍融條件下，復配組具有更好的保水性。

2.3.2 水分分布

核磁共振(nuclear magnetic resonance,NMR)的橫向弛豫時間T2可應用于檢測肉類的水分分布及狀態，且T2時間越小，說明水分與底物結合越緊密，即水分向低自由度遷移[18]。T21(0.01～10 ms) 代表與蛋白質等大分子緊密結合的結合水，T22(10～10 ms) 為存在于肌原纖維及膜之間的不易流動水。T23(100～1 000 ms)代表存在于細胞外或肌原纖維外易流動的自由水[19]。T2反演譜中T21、T22、T23各峰面積占總峰面積的比例分別代表結合水、不易流動水、自由水的相對含量。

如表2所示，分離蛋白組T21、T22隨著凍融次數的增加而減少，其中不同凍融次數的T22有顯著性差異(P<0.05)，但T23隨凍融次數的增加而增加，且有顯著性差異(P<0.05)。說明隨著凍融次數的增加，分離蛋白與自由水之間的結合程度下降。可能因為凍融過程中，冰晶的變化使蛋白質空間結構改變，降低其吸附水的能力[20]，這與保水性實驗結果一致。

表2 凍融循環對分離蛋白T2弛豫時間的影響Table 2 Effect of freeze-thaw cycles on T2 relaxation time of fish protein isolates

T22結果顯示，與分離蛋白相比加入抗凍劑后顯著降低，說明2種抗凍劑夠有效降低不易流動水的流動性，向結合水遷移，并在凍融1次后達到穩定狀態，導致在2次、3次凍融后變化不顯著，有效防止不易流動水的變化。商業抗凍劑與復配組結果均顯示，T23在1次凍融后增加程度較高，說明在1次凍融后自由水流動性增強，會造成解凍損失增加。2次凍融后，商業抗凍劑組和復配組中T23變化較小，始終小于分離蛋白組，說明1次凍融對分離蛋白影響較大，2種抗凍劑均能夠不同程度抑制分離蛋白二級、三級結構的冷凍變性，從而減少水分分布的改變。綜上，商業抗凍劑和復配組能在穩定結合水、自由水的同時,減少不易流動水的流動性，具有較好的保水性。

T2反演譜中結合水、不易流動水、自由水的相對含量如表3所示，隨著凍融次數的增加，自由水的相對含量均顯示出增長的趨勢，而結合水相對含量未出現顯著性差異，因此可得凍融循環會使分離蛋白中不易流動水變為自由水，從而含量減少。在經過3次凍融循環后，分離蛋白組、商業抗凍劑組、復配組自由水含量分別是初始分離蛋白自由水含量的18.04、17.88、11.79倍，自由水易流失，可能造成解凍損失分離蛋白組>商業抗凍劑組>復配組的趨勢，由此可知，復配組能夠有效提高分離蛋白在凍融循環條件下的保水性。

2.3.3 羰基含量

蛋白質羰基多由蛋白質分子受到自由基氧化修飾產生[21]，例如蛋白質一級結構氨基酸分子受到活自由基攻擊氧化生成[22]、蛋白質肽鏈斷裂產生等[23]。因此，可用羰基含量量化蛋白質氧化變性的程度。

如圖4所示，隨著凍融循環次數的增加，各組中羰基含量呈現增高的趨勢，且有顯著性差異(P<0.05)，說明反復凍融會造成蛋白質羰基含量的增高，即造成蛋白質氧化變性程度逐漸變大。1次凍融后，商業抗凍劑組與復配組的羰基含量均小于未凍融組的羰基含量，可能由于凍融前分離蛋白直接暴露于空氣中且溫度較高，造成蛋白氧化迅速從而導致羰基含量增加，而凍融過程在低溫條件下進行，可能在一定程度上減緩蛋白質的氧化變性，另一方面可能是由于抗凍劑中的抗氧化成分逐漸發揮作用，也會抑制蛋白質的氧化變性。相同凍融條件下，商業抗凍劑組的羰基含量始終小于分離蛋白組，說明商業抗凍劑也可減緩蛋白質的氧化變性，可能是通過抑制蛋白質開鏈變性，減少氨基酸的暴露，從而降低氨基酸接觸自由基的幾率[24]。在3次凍融后復配組的羰基含量最低，且與未凍融組、2次凍融后的商業抗凍劑組均無顯著性差異(P>0.05)，可能由于酶解產物具有較強的清除自由基的作用，通過抑制自由基的產生抑制蛋白質的氧化。由此可得，復配組抑制蛋白質氧化變性的能力強于商業抗凍劑組。

2.3.4 巰基含量

巰基(—SH)活性較強，參與維持蛋白質空間結構，但易被氧化為二硫鍵(—S—S—),改變蛋白質的空間結構，巰基含量相應減少[25]。因此巰基含量的變化也可評價蛋白質的氧化變性程度。

如圖5所示，隨著凍融循環次數的增加，分離蛋白組中巰基含量呈現降低的趨勢，且有顯著性差異(P<0.05)，說明蛋白質氧化變性程度逐漸變大，可能由于巰基被氧化為二硫鍵造成蛋白質空間結構改變，也可能發生了使蛋白質巰基含量減少的蛋白質聚集。商業抗凍劑組1～3次凍融后巰基含量無顯著性差異，說明商業抗凍劑能夠在一定程度上穩定蛋白質的空間結構，可能是由于多聚磷酸鹽的添加使其遠離等電點并帶有同種電荷，以及多烴基化合物與蛋白質發生反應，能夠在一定程度上避免蛋白質的聚集[26]。復配組的巰基含量第2次凍融后才出現顯著性降低，且巰基含量高于商業抗凍劑組，說明其維持蛋白質空間結構和抑制巰基氧化程度強于商業抗凍劑組，可能是由于復配組中有高濃度帶負電荷的谷氨酸和天冬氨酸，可與蛋白質形成復合物使之帶有許多負電荷，避免蛋白質聚集[27]，同時酶解產物具有較強的抗氧化能力，能夠在一定程度上抑制蛋白質巰基的氧化，從而抑制蛋白質氧化變性。這與羰基研究結果一致，說明復配組能夠更好地抑制蛋白質氧化變性。

圖5 反復凍融對分離蛋白巰基含量的影響Fig.5 Effect of freeze-thaw cycles on sulfhydry groups content of fish protein isolates

3 結論

綜上，隨著凍融次數的增加，自由水的含量、解凍損失、蒸煮損失都呈現增加的趨勢，但復配組比商業抗凍劑組能夠更好地減緩這種趨勢，尤其是復配組能夠使解凍損失、蒸煮損失分別降低到4.0%、13%以下，同時也降低樣品中不易流動水向自由水的轉換，有效提高分離蛋白的保水性，其抗凍機理一方面可能是酶解產物含有大量的親水性氨基酸，能夠與水作用形成氫鍵，增強凍融循環中水的穩定性，通過有效減少巨大冰晶的形成，阻止蛋白質開鏈變性。另一方面可能是由于KGM與肌球蛋白間形成新的氫鍵，從而形成穩定而致密的網狀結構，增加分離蛋白的抗凍性。羰基、巰基研究結果顯示，復配組能夠有效抑制分離蛋白在凍融循環下的氧化變性，可能由于酶解產物具有較高的抗氧化活性，可有效延緩分離蛋白空間結構改變，提高分離蛋白保水性和抗凍特性。因此可將4.0%藍點馬鮫魚分離蛋白酶解產物和0.5%魔芋復配作為藍點馬鮫魚分離蛋白的抗凍劑，同時符合低甜度、低熱量的消費趨勢。但酶解產物添加后對分離蛋白風味特性的影響并未研究，且較多酶解產物都會呈現明顯的苦味，因此需進一步優化酶解工藝，減少不必要味道的產生。