繅絲廢水發酵產果膠酶的條件優化研究

何海燕， 付 躍， 覃擁靈

（1.河池學院化學與生物工程學院，廣西宜州546300；2.河池學院農業生物技術應用研究中心，廣西宜州546300）

餅粕類飼料原料中添加果膠酶對肉雞回腸氨基酸消化率和代謝能有促進作用；高纖維飼糧中添加果膠酶對鵝生長性能、屠宰性能及肉品質也有良好影響；日糧中添加適量的果膠酶制劑能夠有效地提高鵝對營養物質的消化吸收率。研究表明，果膠酶可作為一種綠色飼料添加劑（毛倩倩等，2013；王寶維等，2011；荊麗珍等，2007；許毅，2004）?？壗z廢水是繅絲廠制絲過程中產生的主要排放物（王家德等，2002），隨著養蠶業和繅絲工業的快速發展， 繅絲廢水的排放量不斷增加，直接排放的廢水會因其含有豐富的有機物而對河道產生較大污染 （石華月等，2019； 杜元源等，2017）。已有的研究大多側重于絲膠蛋白質的回收利用，對廢水回收利用的研究則較少，隨著我國水資源的缺失及政府對水資源保護的重視，繅絲廠用水成本逐漸增加，繅絲廢水的再利用已經成為繅絲廠降低成本、提高經濟收入的重要環節（黃繼偉等，2013；孔育國，2007）。 為充分利用繅絲廢水無毒、 富含絲膠等高分子蛋白有機物，氮和磷含量較高的特點（黃予奕，2018），本研究在前期菌種篩選誘變的基礎上，開展了以繅絲廢水為主要發酵原料生產果膠酶的試驗，初步優化了發酵產酶工藝，以期為繅絲廢水的處理及循環利用提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 沙福芽孢桿菌 （Bacillus safensis），編號G7-7，前期試驗篩選誘變保藏。 發酵原料繅絲廢水由廣西嘉聯絲綢廠提供，放置于冰柜，4 ℃冷藏備用。

1.2 培養基 斜面培養基：1.5%蛋白胨，0.5%酵母膏，1%氯化鈉，瓊脂2%。種子培養基：蔗糖1 g，酵母粉0.5 g， 氯化鈉0.1 g 溶于100 mL 繅絲廢水，pH 9.0。發酵培養基：桔皮粉5 g，蔗糖5 g，磷酸氫二鉀1 g，硫酸鐵0.2 g，溶于1000 mL 繅絲廢水，pH 9.0。

1.3 主要儀器 ZWY-2102 型立式全溫度恒溫搖床 （上海上海智城分析儀器制造有限公司），TDL-5-A 大容量離心機（上海安亭科學儀器廠），infinite M200PRO 全波長酶標儀 （上海精密科學儀器有限公司），PHS-3B 型pH 儀（上海精密科學儀器有限公司），PXY-DHS-400BS 型隔水式電熱恒溫培養箱（上海躍進醫療器械有限公司）。

1.4 粗酶液制備 保藏菌種斜面活化后取2 環轉入種子培養基，30 ℃恒溫培養1 d，再按10%接種量接種至發酵培養基中， 搖床150 r/min、30 ℃恒溫培養3 d，發酵結束后取發酵液離心，上清液即為提取的粗酶液，4 ℃保存備用。

1.5 果膠酶酶活力測定 3，5-二硝基水楊酸（DNS）法，參考王小敏等（2007）的方法適當改良，配制0.4%的果膠底物溶液，50 ℃水浴反應30 min后，加3 mL DNS 終止反應，沸水浴10 min，流水冷卻后定容至15 mL， 搖勻，540 nm 波長測定吸光值。 在上述反應條件下，每分鐘催化果膠底物產生1.0 μmol 半乳糖醛酸所需要的酶量定義為一個酶活力單位（U）。

1.6 產酶條件優化

1.6.1 單因素試驗 選取接種量、 發酵培養基蔗糖添加量、發酵培養基初始pH、發酵溫度、發酵時間和不同誘導物6 個因素， 研究其對果膠酶產量的影響。

1.6.2 正交試驗 根據單因素試驗結果， 選取各因素中酶產量較顯著的水平設計正交試驗， 研究產酶條件的最佳組合。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 接種量對產酶的影響 接種量的大小會影響發酵培養基中菌體數量的多少， 進而影響菌體的生理狀況及代謝產物的合成（劉冬，2015），因此也是發酵工藝重點考察的因素。 本研究按不同接種量把種子培養液接入發酵培養液考察接種量對產酶的影響，結果如圖1，當接種量為14%時，單位體積的酶活力最高，后繼試驗接種量為14%。

2.1.2 發酵培養基蔗糖添加量對產酶的影響 考慮到繅絲廢水中含有豐富的氮源而缺乏微生物生長必需的碳源， 本試驗研究在發酵培養基中添加了一定量的蔗糖以促進微生物菌體的增殖從而促進酶的合成。 結果如圖2， 當蔗糖添加量為9 g/1000 mL 繅絲廢水時，單位體積的酶活力最高。

圖1 接種量對產酶的影響

圖2 發酵培養基蔗糖添加量對產酶的影響

2.1.3 發酵培養基初始pH 對產酶的影響 不同菌株對pH 的耐受能力也不同， 本試驗所用菌株為前期試驗從pH 較高的繅絲廢水中篩選誘變所得，試驗結果顯示該菌株能耐受較高的pH， 在試驗取值范圍內，當pH 為9.0 ～9.5 時，酶活力較高（圖3）。

圖3 發酵培養基初始pH 對產酶的影響

2.1.4 溫度對產酶的影響 溫度不僅影響菌體生長， 同時也極大影響產物合成及發酵液的理化性質， 是發酵中重點控制的因素， 本試驗結果顯示（圖4），溫度為30 ～39 ℃時，單位體積發酵液的酶活力變化不大，說明溫度對產酶影響不顯著，該菌株能適應較寬的溫度變化。

2.1.5 不同發酵時間對產酶的影響 如圖5 所示，隨著發酵時間的延長，酶活力逐漸增強，培養到84 h 時酶活最高，隨后培養液中養料被耗盡，菌體生長緩慢，細胞發生自溶，酶活力又呈下降趨勢。

圖4 溫度對產酶的影響

圖5 不同發酵時間對產酶的影響

2.1.6 不同誘導物對產酶的影響 添加誘導物是提高酶產量的主要措施之一， 試驗參考文獻及結合地方豐富農業廢棄物資源選取了富含果膠質的蠶沙、菠蘿皮、橘皮粉、麩皮、米糠作為產酶誘導物添加到發酵培養基中， 比較不同誘導物對產酶的影響，結果如圖6 所示，在添加量都為5%的試驗條件下，蠶沙的產酶效果優于其他誘導物。

圖6 不同誘導物對產酶的影響

2.2 正交試驗結果 根據單因素試驗結果，選擇接種量、發酵液蔗糖添加量、發酵液初始pH、發酵時間四個因素， 利用正交設計助手Ⅱv3.1 設計正交試驗并進行數據分析，研究最優發酵條件組合，試驗因素水平表和結果見表1 ～3。

表1 正交試驗因素水平表L16（45）

表2 L16（45）正交試驗結果及極差分析

表3 試驗結果方差分析

由表1 和表2 分析得知，R值（極差）的大小排序依次為B＞D＞C＞A， 即對產酶影響最大的是蔗糖添加量，其次為發酵時間、發酵液初始pH和接種量，接種量影響最不顯著。 從表2 中K 值可知，最優發酵組合為A4B4C4D2，即接種量16%，發酵液蔗糖添加量1.1%， 發酵液初始pH 9.5，發酵時間84 h。 由于正交設計表中沒有與此相同的發酵組合， 因此根據此發酵條件做三平行三重復追加試驗，得到酶活均值為21.84 U/mL，是沒優化之前果膠酶活力12.39 U/mL 的1.76 倍。 試驗最后對所得數據進行方差分析（表3）比較各因素的顯著性，結果顯示在試驗設計的4 個因素中，只有發酵液蔗糖添加量對產酶影響達到顯著水平。

3 結論

繅絲廢水可作為微生物發酵的良好材料。 本試驗結果表明，沙福芽孢桿菌的最佳產酶條件為：以5%蠶沙為產酶誘導物， 發酵液蔗糖添加量1.1%，接種量16%，發酵液初始pH 9.5，36 ℃發酵84 h。在此優化的發酵條件下，沙福芽孢桿菌果膠酶酶活達到21.84 U/mL。