肝郁脾虛方對失眠大鼠血漿和下丘腦膽囊收縮素-8的影響

張瑜 王秀峰 曾雪愛 黃俊山

(福建省中醫藥科學院，福州，350003)

失眠是指盡管有合適的睡眠機會和睡眠環境，依然對睡眠時間和(或)質量感到不滿足，并且影響日間社會功能的一種主觀體驗[1]。隨著現代快節奏生活的發展，失眠已經成為常見的睡眠障礙疾病，發病率高達10%～48%。目前失眠的人群年輕化，大多伴隨焦慮、緊張、疲倦等癥狀。前期研究發現肝郁脾虛型失眠占肝郁類失眠的32.7%，比重最大[2]。中醫藥治療肝郁脾虛型失眠療效確切，臨床中多運用針灸[3]、自擬方[4]、經方[5]，同時配合心理疏導[6]以及認知行為療法等，在縮短病程、改善癥狀等方面療效顯著。肝郁脾虛方是黃俊山主任主要針對現代快節奏，高壓力下產生的肝郁、脾虛并存的失眠人群而自擬的經驗方，并根據臨床經驗不斷進行加減優化。主要從疏肝解郁、補脾益氣方面著手進行治療，全方以疏肝解郁為主、補益脾氣為輔，從肝木乘脾土角度治療“肝旺脾虛”型失眠，體現標本兼治、虛實兼顧的治則，臨床療效確切，但作用機制尚不明確，而膽囊收縮素-8對于睡眠和消化道癥狀均有一定的影響。本研究應用肝郁脾虛失眠大鼠模型，通過觀察中樞腦腸肽膽囊收縮素-8的含量變化，進一步為肝郁脾虛方加減防治失眠的理論提供科學實驗依據。

1 材料與方法

1.1 動物 健康雄性(Sprague-Dawley，SD)大鼠40只，體質量(200±20)g，購自上海斯萊克試驗動物有限責任公司[生產許可證號：SCXK(滬)2017～0005，合格證編號：20170005004461]。飼養于恒溫(22±1)℃，12 h:12 h固定照明節律(08:00開燈)的環境下，自由飲水，飼固體飼料。

1.2 主要試劑 對氯苯丙氨酸(PCPA)(批號：C6506-25G)購自Sigma公司，大鼠膽囊收縮素-8(CCk-8)ELISA試劑盒(批號：ML059172-C)購自上海酶聯生物科技有限公司。

1.3 藥品 肝郁脾虛方加減顆粒劑(購自福建中醫藥大學附屬第二人民醫院，主要由甘松、郁金、合歡皮、北柴胡、黨參、黃芪、炒白術、姜半夏、茯神、五味子、甘草組成。大鼠用量為成人的6倍(按體質量計算)，最終配成含生藥低劑量為9.15 g/kg、中劑量為18.3 g/kg、高劑量為36.6 g/kg的溶液)，每天每只予以相應藥液2 mL灌胃。

PCPA的配制：將PCPA充分研磨，溶于弱堿性生理鹽水中，配成混懸液。

1.4 動物分組及造模 將40只大鼠隨機分成5組，正常對照組8只(不參與造模)、肝郁脾虛失眠模型組8只(參與造模，不予給藥)、肝郁脾虛加減方高、中、低劑量組各8只(參與造模，并給藥)，適應性喂養3 d后開始造模。

采用目前睡眠研究領域常用的大鼠慢性夾尾刺激+PCPA腹腔注射復合因子+不規則飲食法(逢單日禁食，飲水正常)制造肝郁脾虛失眠模型，先采用夾尾刺激法致肝郁，除正常對照組外，其余4組的大鼠每籠8只喂養，用尖端包裹紗布的大彎止血鉗，夾住其中一只大鼠的尾巴，令其與籠中其他大鼠撕打，從而激怒全籠大鼠，令全籠大鼠處于對峙狀態，每次刺激30 min，2次/d，連續刺激1周；除正常對照組外，其余4組大鼠逢單日禁食，雙日給予稱好質量的200 g食物，飲水正常；然后采用PCPA按300 mg/kg溶于弱堿性生理鹽水中，配制成混懸液，以10 mL/kg腹腔注射，連續腹腔注射PCPA2d，大鼠晝夜節律消失，睡眠減少直至消失、便溏、飲食量減少、活躍程度減弱，情緒由開始的易怒煩躁變成情緒低落等表示造模成功。

1.5 動物給藥 造模成功后第3天每天8:30開始灌胃，中藥高、中、低劑量組分別按含生藥為36.6 g/kg、18.3 g/kg、9.15 g/kg的溶液灌胃給藥，正常對照組和模型組均給予蒸餾水灌胃，1次/d，共14 d。

1.6 取材

1.6.1 血漿 末次給藥1 h后，戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉各組大鼠。麻醉后迅速下腹主動脈取血，用EDTA-2K真空抗凝管采血3 mL，30 min內2 500×g離心10 min，分離血漿，于-80 ℃保存待測。

1.6.2 下丘腦 取血后立即將5組大鼠斷頭處死，取出大腦，分離下丘腦，用電子秤下丘腦的重量，然后把下丘腦置于玻璃勻漿管內，加入對應體積的PBS(按1∶9的重量體積比)充分研磨，最后將勻漿液于2 500×g離心10 min，取上清液，-80 ℃保存待測。

1.7 酶聯免疫吸附測定 CCK-8含量檢測方法依據ELISA檢測試劑盒操作說明進行。

2 結果

2.1 各組大鼠一般狀態觀察 正常對照組大鼠晝夜節律規律、狀態良好、毛發有光澤、反應靈敏、情緒穩定、大便正常、體質量逐日增加；注射PCPA后，模型組和給藥組大鼠晝夜節律消失、便溏、飲食量減少、活躍程度減弱、情緒由開始的易怒煩躁變成情緒低落。肝郁脾虛方加減顆粒劑用藥后，大鼠精神狀態、便溏、體質量等較模型組有明顯改善。

表1 各組大鼠血漿和下丘腦CCK-8含量比較

2.2 各組大鼠血漿及下丘腦組織CCK-8含量比較 與正常組比較，模型組血漿和下丘腦CCK-8含量均下降，差異有統計學意義(P<0.05)，與模型組比較，給藥中劑量和低劑量組血漿中CCK-8含量增加，差異有統計學意義(P<0.05)，高劑量組、中劑量和低劑量組下丘腦CCK-8含量較模型組均增加，差異有統計學意義(P<0.05)。

3 討論

失眠總病機為陽盛陰衰，陽不入陰，陽盛陰衰易失眠[5]。既往對不寐的病機研究集中在痰熱擾心、肝火擾心、心腎不交、心脾兩虛、心膽氣虛等方面。近年來，社會競爭越來越激烈，工作、學習壓力等越來越大，不能隨心所欲，所欲不順，情志不遂容易導致肝郁，生活節奏的加快，大多數人出現了飲食不規律、饑飽不均或勞累疲倦都容易損傷脾氣。不寐隨著現代生活的改變，出現了新的特點，其中情志和飲食成為了不寐產生的重要病因。歷代醫家對肝郁脾虛失眠早有闡述，《類證治裁》指出“思慮傷脾……經年不寐”。醫圣張機從肝論治失眠非常注重“見肝之病……當先實脾”。肝主疏泄，情志不暢，肝失疏泄，經氣郁滯，木克土，肝郁之氣橫逆犯脾致脾氣虛弱，脾主運化，脾虛氣血生化不足，影響肝藏血疏泄功能，脾氣虛弱，不能運化水谷精微，則容易出現腹脹、便溏等癥狀。肝失疏泄，陰陽出入失調，脾失運化，心失所養，而致肝郁脾虛失眠。

腦腸肽是同時存在在大腦和胃腸道的胃腸激素或神經肽，在中樞神經系統可作為神經遞質起作用，也可作為神經調質起作用，可改變神經末梢對遞質的釋放或改變靶細胞對神經遞質的反應。CCK-8是典型的腦腸肽，也是迄今發現腦中含量最高的多肽，具有膽囊收縮素全部生物活性，在中樞神經系統主要分布在下丘腦、大腦皮質、海馬、杏仁核以及外周血中[7]。腦-腸失衡是失眠發生的核心原因之一[8]，大鼠腹腔注射膽囊收縮素-八肽硫酸酯(CCK)[9]，結果顯示能增加睡眠，增加腦電圖慢波活動，對非快速眼動睡眠有明顯的促進作用，減少運動活動，抑制進食，降低腦溫度。Lanza等[10]報道CCK-8可以促進釋放γ氨基丁酸(GABA)酸的產生，作為一種抑制性神經遞質，通過CCKB受體對延長非快速眼動也發揮生理作用。加味酸棗仁湯[11]在大鼠胃腸不適相關失眠癥模型中具有催眠和胃保護作用，可降低胃酸pH值，降低胃泌素、胃蛋白酶和食欲素-a的生成，增加了MTL和CCK-8的表達，血清GABA濃度升高，Glu/GABA比值降低，改善失眠主要表現為睡眠潛伏期縮短、睡眠時間延長和減少焦慮的行為。

本研究采用目前睡眠研究領域常用的大鼠慢性夾尾刺激+PCPA腹腔注射復合因子+不規則飲食法(逢單日禁食，飲水正常)制造肝郁脾虛失眠模型，其結果顯示，與正常組比較，模型組大鼠血漿和下丘腦中CCK-8的含量減少，肝郁脾虛方加減顆粒劑高、低、中組治療后，中劑量和低劑量組血漿CCK-8含量增加，高劑量組、中劑量組、低劑量組下丘腦CCK-8含量明顯高于模型組。以此顯示，肝郁脾虛方加減對失眠大鼠的調節機制之一可能是通過調控CCK-8來實現，作為神經肽，CCK-8在中樞與γ-氨基丁酸及谷氨酸能神經元共存，在功能上互相調節，肝郁脾虛方加減可增加血漿和下丘腦中CCK-8含量，是否對GABA、5-HT以及腺苷有影響，仍需進一步探討。