人參皂苷Rg3對胰腺癌裸鼠皮下移植瘤新生血管的影響

郭敬強，林勝璋

人參皂苷Rg3對胰腺癌裸鼠皮下移植瘤新生血管的影響

郭敬強1，林勝璋2*

1. 溫州醫科大學附屬五院，麗水市中心醫院，浙江 麗水 323000 2. 浙江樹人大學樹蘭國際醫學院附屬樹蘭杭州醫院，浙江 杭州 310004

探究人參皂苷Rg3對胰腺癌裸鼠皮下移植瘤新生血管形成的影響。裸鼠背側近右后肢處sc胰腺癌SW-1900細胞建立胰腺癌皮下移植瘤模型，將荷瘤裸鼠隨機分為對照組及人參皂苷Rg3低、高劑量（10、20 mg/kg）組。給藥組ip人參皂苷Rg3，對照組ip 0.9%氯化鈉溶液，每2天1次，連續4周。給藥結束3 d后裸鼠脫頸椎處死，取瘤組織。采用免疫組化法檢測各組裸鼠瘤組織中內皮細胞標記物CD31表達，計算微血管密度；采用qRT-PCR和Western blotting法檢測各組裸鼠瘤組織中血管內皮鈣黏素（vascular endothelial cadherin，VE-cadherin）、絡氨酸激酶受體A2（erythropoietin-producing hepatocellular receptor A2，EphA2）mRNA和蛋白表達水平。與對照組比較，人參皂苷Rg3組胰腺癌裸鼠皮下移植瘤質量顯著降低（＜0.05），微血管密度顯著降低（＜0.05），VE-cadherin、EphA2 mRNA和蛋白表達水平均顯著降低（＜0.05）。人參皂苷Rg3可能通過調控VE-cadherin、EphA2 mRNA和蛋白表達，從而抑制胰腺癌裸鼠皮下移植瘤新生血管形成。

人參皂苷Rg3；胰腺癌；新生血管；血管內皮鈣黏素；絡氨酸激酶受體A2

胰腺癌是臨床常見的消化系統惡性腫瘤，發病率位居惡性腫瘤第7位，病死率位居第6位[1]。胰腺癌惡性程度高，由于其生物學特性，患者早期無特異性臨床癥狀，病情進展迅速，部分患者就診時已發展為晚期階段，臨床治療效果不佳[1-2]。目前臨床以手術、靶向、免疫等治療及化療為主[3]。研究發現，腫瘤新生血管的形成與機體血液循環有關，可促進腫瘤的生長、轉移與侵襲[4-5]。因此，基于腫瘤新生血管的研究是開發抗腫瘤藥物的新方向。人參具有顯著的抗腫瘤作用，人參皂苷是其主要活性成分。人參皂苷Rg3具有抑制新生血管形成的作用[6-8]，臨床常將以人參皂苷Rg3為主要活性成分的參一膠囊用于多種腫瘤的輔助治療。本研究通過建立胰腺癌裸鼠皮下移植瘤模型，考察人參皂苷Rg3對裸鼠腫瘤新生血管的影響，并探討人參皂苷Rg3抑制胰腺癌新生血管形成的作用機制。

1 材料

1.1 動物

SPF級雄性BALB/C裸鼠，4～6周齡，體質量18～22 g，購自中國科學院上海實驗動物中心，合格證號SYXK（浙）2015-0009。動物飼養于溫州醫科大學SPF級屏障系統的潔凈層流架內，溫度（25±1）℃、相對濕度40%～60%，自由進食飲水。動物實驗經溫州醫科大學實驗動物中心倫理委員會批準（批準號wydw2019-0012）。

1.2 細胞

胰腺癌SW-1990細胞株購自美國ATCC。

1.3 藥品與試劑

人參皂苷Rg3（質量分數≥98%）購自上海博蘊生物科技有限公司；血管內皮鈣黏素（vascular endothelial cadherin，VE-cadherin）抗體購自美國abgent公司；絡氨酸激酶受體A2（erythropoietin- producing hepatocellular receptor A2，EphA2）抗體購自美國R&D公司；CD31抗體購自美國Santa Cruz公司；山羊抗鼠生物素標記的抗體購自美國Earthox公司；DMEM培養基購自美國Gibco公司；熒光定量PCR試劑盒購自瑞士Roche公司；ECL化學發光法檢測試劑盒購自美國Thermo公司；BCA蛋白定量試劑盒購自美國Pierce公司；免疫組化二步法試劑盒、DAB顯色劑購自北京中杉金橋生物有限公司。

1.4 儀器

Elx800型全自動酶標儀（奧地利KIALAB公司）；電泳儀、電泳槽（美國Bio-Rad公司）；3111型CO2細胞培養箱（美國Thermo公司）；TS100倒置顯微鏡、E4500型照相機（日本Nikon公司）；Image-proplus 6.0免疫組化彩色圖像（美國Media Cybemetics公司）；GS-15R低溫高速離心機（美國Beckman公司）。

2 方法

2.1 細胞培養

SW-1990細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養基，于37 ℃、飽和濕度、5% CO2的培養箱中培養，細胞生長至70%～80%時進行傳代。

2.2 動物模型建立、分組與給藥

取處于對數生長期的SW-1990細胞，用DMEM培養基調整細胞密度為3×106/L，于裸鼠背側近右后肢處sc 100 μL細胞懸浮液，1周后，按照文獻方法[9]，將荷瘤裸鼠隨機分為對照組及人參皂苷Rg3低、高劑量（10、20 mg/kg）組，每組8只。人參皂苷Rg3溶于生理鹽水配制成質量濃度為l mg/mL的溶液，給藥組ip人參皂苷Rg3，對照組ip 0.9%氯化鈉溶液，每2天1次，連續4周。給藥結束3 d后，裸鼠脫頸椎處死，取瘤組織，稱定瘤質量并計算人參皂苷Rg3的抑瘤率。

抑瘤率＝(對照組平均瘤質量－給藥組平均瘤質量)/對照組平均瘤質量

2.3 人參皂苷Rg3對荷瘤裸鼠皮下移植瘤微血管密度的影響

各組瘤組織于4%多聚甲醛中固定48 h，縱行切取瘤組織，于自動組織處理機處理并切片，采用免疫組化法檢測血管標志物CD31表達情況。根據Weidner計數方法，鏡下觀察微血管呈棕色的單個或成簇細胞，在100×光鏡下尋找病灶微血管密度高的區域，在400×光鏡下隨機計算5個視野下的微血管數，計算其平均值，作為腫瘤微血管密度。

2.4 人參皂苷Rg3對荷瘤裸鼠皮下移植瘤VE-cadherin和EphA2 mRNA表達的影響

按照Trizol試劑盒說明書提取瘤組織總RNA，按照逆轉錄試劑盒說明書合成cDNA，進行qRT-PCR分析。引物序列：上游引物5’-AAGCGTGAGTCGCAA-3’、下游引物5’-TCTC- CAGGTTTTCGC-3’；上游引物5’-GAGGGC- GTCATCTCCAAATA-3’、下游引物5’-TCAGACAC- CTTGCAGACCAG-3’；上游引物5’-GAGT- CAACGGATTTGGTCGT-3’、下游引物5’-TTGATT- TTGGAGGGATCTCG-3’。

2.5 人參皂苷Rg3對荷瘤裸鼠皮下移植瘤VE-cadherin和EphA2蛋白表達的影響

取100 mg瘤組織，加入0.8 mL裂解液研磨，于冰上孵育30 min，40 ℃、12 000 r/min離心5 min；超聲裂解3次，40 ℃、12 000 r/min離心20 min，取上清，采用BCA定量試劑盒測定蛋白質量濃度。蛋白樣本經12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉2 h，分別加入VE-cadherin、EphA2抗體，于4 ℃孵育過夜；TBS洗滌3次，加入山羊抗鼠生物素標記的抗體，室溫孵育2 h；TBS洗滌3次，加入ECL化學發光液曝光顯像，采用Alpha Ease FC 4.0軟件分析結果。

2.6 統計學分析

3 結果

3.1 人參皂苷Rg3對荷瘤裸鼠皮下移植瘤的影響

如表1所示，與對照組比較，人參皂苷Rg3組荷瘤裸鼠皮下移植瘤質量顯著降低（＜0.05），呈劑量相關性。

3.2 人參皂苷Rg3對荷瘤裸鼠皮下移植瘤微血管密度的影響

如圖1和表2所示，與對照組比較，人參皂苷Rg3組皮下移植瘤微血管密度顯著降低（＜0.05），呈劑量相關性。

表1 人參皂苷Rg3對荷瘤裸鼠皮下移植瘤的影響()

與對照組比較：*＜0.05，下表同

*< 0.05control group, same as below tables

圖1 人參皂苷Rg3對胰腺癌裸鼠皮下移植瘤微血管密度的影響(×400)

表2 人參皂苷Rg3對胰腺癌裸鼠皮下移植瘤微血管密度的影響()

3.3 人參皂苷Rg3對荷瘤裸鼠皮下移植瘤VE-cadherin和EphA2 mRNA表達的影響

如表3所示，與對照組比較，人參皂苷Rg3組荷瘤裸鼠皮下移植瘤中和mRNA水平顯著降低（＜0.05），呈劑量相關性。

3.4 人參皂苷Rg3對荷瘤裸鼠皮下移植瘤VE-cadherin和EphA2蛋白表達的影響

如圖2和表4所示，與對照組比較，人參皂苷Rg3組荷瘤裸鼠皮下移植瘤中VE-cadherin和EphA2蛋白表達水平顯著降低（＜0.05），呈劑量相關性。

表3 人參皂苷Rg3對荷瘤裸鼠皮下移植瘤VE-cadherin和EphA2 mRNA表達的影響()

圖2 人參皂苷Rg3對荷瘤裸鼠皮下移植瘤VE-cadherin和EphA2蛋白表達的影響

4 討論

腫瘤轉移與腫瘤的微血管生成密切相關，微血管生成可作為腫瘤轉移、復發和預后的重要指標[10]。本研究結果顯示，與對照組比較，人參皂苷Rg3組荷瘤裸鼠皮下移植瘤質量降低，微血管生成減少，表明人參皂苷Rg3通過抑制荷瘤裸鼠皮下移植瘤微血管生成，從而抑制皮下移植瘤生長。局部的毛細血管基底膜降解，血管內皮細胞增殖并遷移，內皮細胞形成新的毛細血管。VE-cadherin僅在內皮細胞表達，是內皮細胞特異性標志物，在維持血管內皮細胞極性和完整性中發揮重要作用。VE-cadherin的表達與腫瘤的發生密切相關，VE-cadherin可促進內皮細胞向腫瘤病灶的黏附、遷移，促進病灶內新生血管的形成[11]，且與腫瘤體積呈正相關[12-13]。EphA2是Eph受體絡氨酸激酶家族成員之一，在多種惡性腫瘤或細胞株中高表達[14]。EphA2與其配體Ephrin A1結合后，激活下游胞質底物蛋白，在腫瘤新生血管形成中發揮重要作用[15]。阻斷EphA2信號轉導或阻斷EphA受體酪氨酸激酶可抑制腫瘤血管生成[14]。研究發現，VE-cadherin可重新分布EphA2的配體，使EphA2與EphrinA1結合[16]。本研究結果顯示，與對照組比較，人參皂苷Rg3組荷瘤裸鼠皮下移植瘤VE-cadherin、EphA2蛋白和mRNA表達水平均顯著降低，提示人參皂苷Rg3可抑制血管內皮細胞增殖、遷移，下調VE-cadherin、EphA2蛋白和mRNA表達，阻止EphA2與其配體結合，阻斷EphA2信號轉導。

表4 人參皂苷Rg3對荷瘤裸鼠皮下移植瘤VE-cadherin和EphA2蛋白表達的影響()

本研究表明，人參皂苷Rg3可抑制VE-cadherin、EphA2蛋白和mRNA表達，抑制瘤組織血管生成，從而提高荷瘤裸鼠生存質量。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Effect of ginsenoside Rg3on neovascularization of subcutaneous transplantation tumor of pancreatic cancer in nude mice

GUO Jing-qiang1, LIN Sheng-zhang2

1. Fifth Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Lishui Central Hospital, Lishui 323000, China 2. Shulan Hangzhou Hospital Affiliated to Zhejiang Shuren University, Shulan International Medical College, Hangzhou 310004, China

To explore the effect of ginsenoside Rg3on the angiogenesis of subcutaneously transplanted tumor of pancreatic cancer in nude mice.Back of nude mice near the right hind limb were sc pancreatic cancer SW-1900 cells to establish a pancreatic cancer subcutaneous transplantation tumor model. Tumor-bearing nude mice were randomly divided into control group, low- and high-dose ginsenoside Rg3(10, 20 mg/kg) groups. Rats in administration group were ip ginsenoside Rg3and rats in control group were ip 0.9% sodium chloride solution, once every 2 d for four consecutive weeks. Three days after administration, nude mice were sacrificed by cervical vertebrae, and tumor tissues were collected. Immunohistochemical method was used to detect the expression of endothelial cell marker CD31 in the tumor tissues of nude mice, and the microvessel density was calculated. qRT-PCR and Western blotting were used to detect vascular endothelial cadherin (VE-cadherin), erythropoietin-producing hepatocellular receptor A2 (EphA2) mRNA and protein expression levels.Compared with the control group, the weight of subcutaneously transplanted pancreatic cancer nude mice in ginsenoside Rg3group were significantly reduced (< 0.05); Microvessel density were significantly reduced (< 0.05), mRNA and protein expression levels of VE-cadherin and EphA2 were significantly reduced (< 0.05).Ginsenoside Rg3can regulate the expression of VE-cadherin and EphA2 mRNA and protein expression, thereby inhibiting the angiogenesis of subcutaneously transplanted pancreatic cancer in nude mice.

ginsenoside Rg3; pancreatic cancer; angiogenesis; vascular endothelial cadherin; erythropoietin-producing hepatocellular receptor A2

R285.5

A

0253 - 2670(2021)06 - 1668 - 04

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.06.015

2020-10-25

郭敬強，男，碩士研究生，主治醫師，從事肝膽胰臨床研究。

林勝璋，男，醫學博士，主任醫師，教授，博士研究生導師，從事肝膽胰腫瘤治療基礎與臨床研究。E-mail: wzfz1sz@163.com

[責任編輯 李亞楠]