伊犁貝母中化學成分及其體外抗腫瘤活性研究

金悅仙，魏鴻雁，馬曉玲，陳 剛，石磊嶺*，張 晶

伊犁貝母中化學成分及其體外抗腫瘤活性研究

金悅仙1, 2，魏鴻雁2，馬曉玲2，陳 剛2，石磊嶺2*，張 晶1*

1. 吉林農業大學中藥材學院，吉林 長春 130118 2. 新疆維吾爾自治區中藥民族藥研究所，新疆 烏魯木齊 830002

研究伊犁貝母的化學成分及其體外抗腫瘤活性。應用多種色譜方法進行分離純化，利用NMR、MS等波譜技術結合理化性質進行結構鑒定；并采用MTT法評價化合物對子宮頸癌HeLa細胞、結腸癌Ht-29細胞和人惡性黑色素瘤A375細胞的體外抑制活性。從伊犁貝母95%乙醇提取物中分離得到13個化合物，分別鑒定為1--阿魏酰單甘油酯（1）、4-羥基苯甲醛（2）、環()-脯-()-苯丙（3）、香草酸（4）、2-羥基-3-苯基丙酸甲酯（5）、燈盞花苷II（6）、反式肉桂酸甲酯（7）、西貝母堿（8）、阿魏酸乙酯（9）、貝母辛（10）、環(脯氨酸-甘氨酸)（11）、西貝母堿苷（12）、6,7-二甲氧基-2-萘乙酸（13）。化合物1～7、9、11、13為首次從伊犁貝母屬中分離得到；化合物3、8、10～12對3種腫瘤細胞株具有不同程度的抑制活性，其中化合物10活性較強，其半數抑制濃度（IC50）分別為22.07、52.47、48.27 μmol/L。

伊犁貝母；生物堿類；抗腫瘤活性；燈盞花苷II；西貝母堿；貝母辛；西貝母堿苷

伊犁貝母Schrenk為百合科（Liliaceae）貝母屬L.植物，主要分布于新疆伊犁河流域[1-2]。其鱗莖入藥，味苦、甘、微涼，歸肺、心經，臨床上是用于治療呼吸系統疾病的良藥。伊犁貝母被收錄在《中國藥典》2015年版中的“伊貝母”項下[3]，是新疆維吾爾族傳統維藥之一[4]，且產量較高，和同類貝母相比較具有較高的生物堿含量[5]。現代藥理學表明，伊犁貝母具有鎮咳祛痰、抗炎、抗菌等生理活性[6-7]。為進一步闡明伊犁貝母的物質基礎，本研究對伊犁貝母95%乙醇提取物進行了系統研究，分離得到了13個化合物，分別鑒定為1--阿魏酰單甘油酯（1--feruloylglycerol，1）、4-羥基苯甲醛（4-hydroxy- benzaldehyde，2）、環()-脯-()-苯丙[cyclo()-Pro- ()-Phe，3]、香草酸（vanillic acid，4）、2-羥基-3-苯基丙酸甲酯（2-hydroxy-3-phenylpropanoic acid methyl ester，5）、燈盞花苷II（erigeside II，6）、反式肉桂酸甲酯（methyl cinnamate，7）、西貝母堿（imperialine，8）、阿魏酸乙酯[ethyl 3-(4-hydroxy- 3-methoxyphenyl) acrylate，9]、貝母辛（peimisine，10）、環(脯氨酸-甘氨酸)[cyclo(pro-gly)，11]、西貝母堿苷（sipeimine-3β--glucoside，12）、6,7-二甲氧基-2-萘乙酸（6,7-dimethoxynaphthalene-2- carboxylic acid，13）。其中，化合物1～7、9、11、13為首次從伊犁貝母屬中分離得到。通過MTT法評價了13個化合物針對人宮頸癌HeLa細胞、結腸癌Ht-29細胞、人惡性黑色素瘤A375細胞的體外抑制活性，結果顯示化合物3、8、10～12分別對3種腫瘤細胞株具有不同程度的抑制活性，其中化合物10活性最強，其半數抑制濃度（IC50）分別為22.07、52.47、48.27 μmol/L。

1 儀器與材料

Bruker Avance III 600型核磁共振波譜儀（德國Bruker公司）；賽默飛世LTQ-Obitrap XL液質聯用儀（美國Thermo Fisher公司）；柱色譜硅膠和薄層色譜用硅膠G、H、GF254（青島海洋化工有限公司）；HW-40C凝膠（Toyopearl公司），V-3003K型旋轉蒸發儀、SZ-93型循環水真空泵（上海振捷實驗設備有限公司）；超聲波清洗儀（天津科貝爾光電技術有限公司）；BS223S分析天平（北京賽多利斯儀器系統有限公司）；常規試劑均為分析純（北京化工廠）。

伊犁貝母（栽培）采自新疆博爾塔拉蒙古自治州溫泉縣安格里格鄉奇其爾根布呼村，經新疆維吾爾自治區中藥民族藥研究所賈曉光研究員鑒定為伊犁貝母Schrenk的干燥鱗莖。

2 提取與分離

取伊犁貝母鱗莖部20 kg，均分成2部分，陰干，粉碎為粗粉，每個部分（10 kg）均用體積分數95%乙醇回流提取3次，每次2 h，合并提取液，減壓回收溶劑，得到的總浸膏分為2部分，第1部分浸膏（1089 g）、第2部分浸膏（991 g）。

第1部分總浸膏用水分散后，依次用石油醚、氯仿、醋酸乙酯各萃取3次，萃取液減壓濃縮至干，最終得到石油醚部位浸膏49.2 g、氯仿部位浸膏56.1 g、醋酸乙酯部位浸膏94.5 g。取氯仿部位浸膏（56.1 g）經硅膠柱（100～200目）色譜，石油醚-氯仿（40∶1→0∶1）、氯仿-甲醇（80∶1→0∶1）梯度洗脫得到10個流分Fr. 1～10。Fr. 5（2.7 g）經硅膠柱（100～200目）色譜，石油醚-氯仿（1∶1.5→0∶1）、氯仿-甲醇（80∶1→0∶1）梯度洗脫得到8個流分Fr. 5-1～5-8。Fr. 5-4經HPLC半制備色譜（YMC-Pack ODS-A，250 mm×10 mm，5 μm，60%甲醇）得到化合物1（2.4 mg）和2（2.3 mg）。Fr. 5-6經C18反相柱色譜（30%～90%甲醇溶液梯度洗脫）得到6個流分Fr. 5-6-1～5-6-6，Fr. 5-6-2經HPLC半制備色譜（YMC-Pack ODS-A，250 mm×10 mm，5 μm，65%甲醇）得到化合物3（3.2 mg）。Fr. 6（2.9 g）經C18反相柱色譜（30%～90%甲醇溶液梯度洗脫）得到6個流分Fr. 6-1～6-6，Fr. 6-1經反復凝膠及高效液相色譜分離純化得到化合物4（4.9 mg）。Fr. 7（3.1g）經C18反相柱色譜（30%～90%甲醇溶液梯度洗脫）得到6個流分Fr. 7-1～7-6，Fr. 7-2經HPLC半制備色譜（YMC-Pack ODS-A，250 mm×10 mm，5 μm，60%甲醇）得到化合物5（2.9 mg）。Fr. 9（3.3 g）經C18反相柱色譜（30%～90%甲醇梯度洗脫）得到6個流分Fr. 9-1～9-6，Fr. 9-2經HPLC半制備色譜（YMC-Pack ODS-A，250 mm×10 mm，5 μm，55%甲醇）得到化合物6（3.4 mg）。

第2部分用2%鹽酸（pH 3.5）捏溶，濾得酸液，將酸液用石油醚萃取脫脂, 然后用氨水調pH值至10，依次用氯仿及水飽和的正丁醇萃取，得到氯仿部位（18.2 g）和正丁醇部位（70.3 g）。取氯仿部位浸膏（18.2 g）經硅膠柱（100～200目）色譜，石油醚-丙酮-三乙胺（20∶1∶0.1→1∶5∶0.1）梯度洗脫得到9個流分Fr. A～I。Fr. A經反復硅膠、凝膠色譜分離純化，得到化合物7（2.8 mg）。Fr. B經反復重結晶得到化合物8（30 mg）。Fr. C經HPLC半制備色譜（YMC-Pack ODS-A，250 mm×10 mm，5 μm，60%甲醇）得到化合物9（2.5 mg）。Fr. E經HPLC半制備色譜（YMC-Pack ODS-A，250 mm×10 mm，5 μm，70%甲醇）得到化合物10（3.1 mg）和11（4.4 mg）。Fr. G經反復重結晶得到化合物12（62.3 mg），其母液經HPLC半制備色譜（YMC-Pack ODS-A，250 mm×10 mm，5 μm，48%甲醇）得到化合物13（2.9 mg）。

3 結構鑒定

化合物1：淡黃色油狀物，ESI-MS/: 291 [M＋Na]+（計算值291，C13H16O6Na [M＋Na]+）。1H-NMR (600 MHz, CDCl3): 7.68 (1H, m, H-7′), 7.08 (1H, m, H-2′), 7.04 (1H, m, H-6′), 6.93 (1H, m, H-5′), 6.36 (1H, m, H-8′), 4.37 (2H, m, H-1), 3.86 (1H, m, H-2), 3.85 (2H, m, H-3), 3.92 (3H, s, 3′-OMe)；13C-NMR (150 MHz, CDCl3): 168.9 (C-9′), 146.3 (C-3′), 146.2 (C-7′), 146.1 (C-4′), 126.9 (C-1′), 123.6 (C-6′), 114.9 (C-5′), 114.6 (C-8′), 109.5 (C-2′), 72.6 (C-2), 65.6 (C-1), 62.4 (C-3), 56.1 (3′-OMe)。以上數據與文獻報道一致[8]，故鑒定化合物1為1--阿魏酰單甘油酯。

化合物2：淡黃色油狀物，ESI-MS/: 145 [M＋Na]+（計算值145，C7H6O2Na [M＋Na]+）。1H-NMR (600 MHz, CDCl3): 7.82 (1H, d,= 8.4 Hz, H-2), 6.96 (1H, d,= 8.4 Hz, H-3), 6.94 (1H, d,= 8.4 Hz, H-5), 7.81 (1H, d,= 8.4 Hz, H-6), 9.88 (1H, s, 1-CHO), 5.67 (1H, s, 4-OH)；13C-NMR (150 MHz, CDCl3): 130.3 (C-1), 132.5 (C-2), 116.1 (C-3), 161.2 (C-4), 116.1 (C-5), 132.5 (C-6), 190.9 (1-CHO)。以上數據與文獻報道一致[9]，故鑒定化合物2為4-羥基苯甲醛。

化合物3：淡黃色油狀物，ESI-MS/: 267 [M＋Na]+（計算值267，C14H16N2O2Na [M＋Na]+）。1H-NMR (600 MHz, CDCl3): 4.29 (1H, m, H-2), 2.52, 2.50 (2H, m, H-3), 3.34, 2.33 (2H, m, H-4), 3.59, 3.57 (2H, m, H-5), 4.30 (1H, m, H-2′), 2.82, 2.80 (2H, m, H-3′), 7.35 (1H, m, H-5′), 7.34 (1H, m, H-6′), 7.30 (1H, m, H-7′), 7.29 (1H, m, H-8′), 7.23 (1H, m, H-9′)。13C-NMR (150 MHz, CDCl3): 169.8 (C-1), 60.3 (C-2), 28.8 (C-3), 22.7 (C-4), 45.6 (C-5), 165.2 (C-1′), 56.4 (C-2′), 37.0 (C-3′), 136.0 (C-4′), 129.4 (C-5′), 129.3 (C-6′), 127.7 (C-7′), 129.4 (C-8′), 129.3 (C-9′)。以上數據與文獻報道一致[10]，故鑒定化合物3為環()-脯-()-苯丙。

化合物4：淡黃色油狀物，ESI-MS/: 191 [M＋Na]+（計算值191，C8H8O4Na [M＋Na]+）。1H-NMR (600 MHz, CDCl3): 7.58 (1H, d,= 1.8 Hz, H-3), 6.98 (1H, d,=1.8 Hz, H-6), 7.72 (1H, dd,=1.8 Hz, 8.4 Hz, H-7), 7.43 (1H, s, COOH), 7.08 (1H, s, 5-OH), 3.49 (3H, s, 4-OMe)；13C-NMR (150 MHz, CDCl3): 169.7 (C-1), 121.3 (C-2), 114.4 (C-3), 150.8 (C-4), 146.4 (C-5), 112.2 (C-6), 114.4 (C-7), 56.3 (4-OMe)。以上數據與文獻報道一致[11]，故鑒定化合物4為香草酸。

化合物5：淡黃色油狀物，ESI-MS/: 203 [M＋Na]+（計算值203，C10H12O3Na [M＋Na]+）。1H-NMR (600 MHz, CDCl3): 7.31 (1H, m, H-4′), 7.29 (2H, m, H-3′, 5′), 7.21 (2H, m, H-2′, 6′), 4.48 (1H, dd,= 7.2, 5.4 Hz, H-2), 3.20 (1H, dd,= 4.2, 13.8 Hz, H-3α), 3.14 (1H, dd,= 4.2, 13.8 Hz, H-3β), 3.77 (3H, s, 1-OMe)；13C-NMR (150 MHz, CDCl3): 174 (C-1), 136.6 (C-1′), 129.8 (C-3′), 129.6 (C-5′), 128.6 (C-4′), 127.1 (C-2′, 6′), 71.4 (C-2), 40.7 (C-3), 56.8 (1-OMe)。以上數據與文獻報道一致[12]，故鑒定化合物5為2-羥基-3-苯基丙酸甲酯。

化合物6：淡黃色油狀物，ESI-MS/: 365 [M＋Na]+（計算值365，C16H22O8Na [M＋Na]+）。1H-NMR (600 MHz, CDCl3): 6.44 (1H, s, H-3), 6.44 (1H, s, H-5), 7.05 (1H, m, H-7), 5.14, 5.90 (2H, m, H-8), 5.93 (1H, m, H-9), 3.80 (1H, m, H-10), 3.49 (1H, m, H-11), 3.61 (1H, m, H-12), 3.91 (1H, m, H-13), 3.82 (2H, m, H-14), 2.04 (4H, s, 11～14-OH), 3.85 (3H, s, 2-OMe), 3.85 (3H, s, 6-OMe)；13C-NMR (150 MHz, CDCl3): 137.8 (C-1), 152.7 (C-2), 106.7 (C-3), 120.1 (C-4), 106.7 (C-5), 152.7 (C-6), 136.9 (C-7), 116.7 (C-8), 105.7 (C-9), 76.8 (C-10), 70.4 (C-11), 74.4 (C-12), 74.4 (C-13), 62.6 (C-14), 56.4 (2-OMe), 56.4 (6-OMe)。以上數據與文獻報道一致[13]，故鑒定化合物6為燈盞花苷II。

化合物7：淡黃色油狀物，ESI-MS/: 185 [M＋Na]+（計算值185，C10H10O2Na [M＋Na]+）。1H-NMR (600 MHz, CDCl3): 7.7 (1H, d,= 15.6 Hz, H-7), 7.57 (1H, dd,= 1.2, 2.4 Hz, H-4), 7.56 (1H, d,= 2.4 Hz, H-3, 5), 7.42 (2H, d,= 1.2 Hz, H-2, 6), 6.46 (1H, d,= 16.2 Hz, H-8), 3.81 (3H, s, H-10)；13C-NMR (150 MHz, CDCl3): 167.6 (C-9), 145.1 (C-7), 134.5 (C-1), 130.4 (C-2, 6), 129.1 (C-4), 128.2 (C-3, 5), 117.9 (C-8), 51.9 (C-10)。以上數據與文獻描述一致[14]，故鑒定化合物7為反式肉桂酸甲酯。

化合物8：白色粉末，ESI-MS/: 452 [M＋Na]+（計算值452，C27H43NO3Na [M＋Na]+）。1H-NMR (600 MHz, CDCl3): 1.47 (2H, m, H-1), 1.76 (2H, m, H-2), 3.46 (2H, s, H-3), 2.01 (2H, m, H-4), 2.38 (1H, m, H-5), 2.38 (2H, m, H-7), 1.74 (1H, m, H-8), 1.47 (1H, m, H-9), 1.55 (2H, m, H-11), 1.40 (1H, m, H-12), 1.61 (1H, m, H-13), 1.40 (1H, m, H-14), 1.53 (4H, m, H-15, 16), 1.48 (1H, m, H-17), 2.38 (4H, m, H-18, 26), 1.15 (3H, m, H-19), 1.47 (1H, m, H-20), 1.33 (3H, m, H-21), 2.38 (1H, m, H-22), 1.59 (4H, m, H-23, 24), 1.61 (1H, m, H-25), 1.09 (3H, m, H-27), 2.02 (1H, m, 3-OH), 2.01 (1H, m, 20-OH)；13C-NMR (150 MHz, CDCl3): 30.6 (C-1), 30.4 (C-2), 70.6 (C-3), 30.4 (C-4), 56.7 (C-5), 211.1 (C-6), 46.6 (C-7), 39.1 (C-8), 56.5 (C-9), 38.3 (C-10), 30.6 (C-11), 40.3 (C-12), 39.1 (C-13), 46.6 (C-14), 26.9 (C-15), 19.6 (C-16), 49.0 (C-17), 59.8 (C-18), 22.4 (C-19), 72.1 (C-20), 22.4 (C-21), 70.8 (C-22), 19.8 (C-23), 37.6 (C-24), 27.8 (C-25), 61.4 (C-26), 17.3 (C-27)。以上數據與文獻報道一致[15]，故鑒定化合物8為西貝母堿。

化合物9：淡黃色油狀物，ESI-MS/: 245 [M＋Na]+（計算值245，C12H14O4Na [M＋Na]+）。1H-NMR (600 MHz, CDCl3): 7.63 (1H, d,= 15.6 Hz, H-7), 7.08 (1H, dd,= 2.4, 8.4 Hz, H-6), 7.04 (1H, d,= 2.4 Hz, H-2), 6.93 (1H, d,= 8.4 Hz, H-5), 6.30 (1H,= 15.6 Hz, H-8), 4.27 (2H, q,= 7.2 Hz, H-10), 3.93 (3H, s, 3-OMe), 1.35 (3H, t,= 7.2 Hz, 10-Me)；13C-NMR (150 MHz, CDCl3): 167.5 (C-9), 148.0 (C-4), 147.8 (C-3), 144.9 (C-7), 127.6 (C-1), 123.2 (C-2), 115.8 (C-5), 114.8 (C-6), 109.4 (C-8), 60.6 (C-10), 56.1 (3-OMe), 14.6 (10-Me)。以上數據與文獻報道一致[16]，故鑒定化合物9為阿魏酸乙酯。

化合物10：白色粉末，ESI-MS/: 450 [M＋Na]+（計算值450，C27H41NO3Na [M＋Na]+）。1H-NMR (600 MHz, CDCl3): 1.47 (2H, m, H-1), 1.73 (2H, m, H-2), 3.17 (1H, m, H-3), 1.74 (2H, m, H-4), 2.30 (2H, m, H-7), 1.75 (1H, m, H-8), 1.76 (1H, m, H-9), 1.16 (1H, m, H-10), 2.09 (2H, m, H-11), 1.73 (1H, m, H-13), 2.09 (1H, m, H-14), 1.74 (2H, m, H-15), 1.75 (2H, m, H-16), 1.63 (3H, m, H-18), 1.16 (3H, m, H-19), 2.28 (1H, m, H-20), 1.09 (3H, s, H-21), 2.81 (1H, t,= 7.2 Hz, H-22), 3.79 (1H, t,= 7.2 Hz, H-23), 1.72 (2H, m, H-24), 1.47 (1H, m, H-25), 2.64 (2H, m, H-26), 1.03 (3H, d,= 7.2 Hz, H-27)；13C-NMR (150 MHz, CDCl3): 39.1 (C-1), 31.7 (C-2), 70.5 (C-3), 37.1 (C-4), 56.7 (C-5), 210.6 (C-6), 45.8 (C-7), 46.0 (C-8), 54.5 (C-9), 38.5 (C-10), 28.5 (C-11), 128.5 (C-12), 141.0 (C-13), 48.6 (C-14), 24.2 (C-15), 30.0 (C-16), 85.1 (C-17), 13.1 (C-18), 12.5 (C-19), 39.7 (C-20), 10.7 (C-21), 66.3 (C-22), 75.6 (C-23), 30.4 (C-24), 31.6 (C-25), 54.7 (C-26), 18.9 (C-27)。以上數據與文獻報道一致[15]，故鑒定化合物10為貝母辛。

化合物11：淡黃色油狀物，ESI-MS/: 177 [M＋Na]+（計算值177，C7H10N2O2Na [M＋Na]+）。1H-NMR (600 MHz, CDCl3): 3.61 (2H, s, H-3), 2.09 (2H, m, H-4), 2.35 (2H, m, H-5), 4.68 (1H, m, H-6), 8.11 (1H, m, NH-8), 4.05 (2H, m, H-9)；13C-NMR (150 MHz, CDCl3): 159.1 (C-1, C=O), 153.6 (C-2, C=O), 45.5 (C-3), 25.3 (C-4), 29.8 (C-5), 63.1 (C-6), 46.7 (C-9)。以上數據與文獻報道一致[17]，故鑒定化合物11為環(脯氨酸-甘氨酸)。

化合物12：白色粉末，ESI-MS/: 614 [M＋Na]+（計算值614，C33H53NO8Na [M＋Na]+）。1H-NMR (600 MHz, CDCl3): 1.47 (2H, m, H-1), 1.76 (2H, m, H-2), 2.53 (1H, m, H-3), 2.01 (2H, m, H-4), 2.38 (1H, m, H-5), 2.39 (2H, m, H-7), 1.74 (1H, m, H-8), 1.47 (1H, m, H-9), 1.55 (2H, m, H-11), 1.40 (2H, m, H-12), 1.61 (1H, m, H-13), 1.40 (1H, m, H-14), 1.53 (4H, m, H-15, 16), 1.48 (1H, m, H-17), 2.38 (4H, m, H-18, 26), 1.15 (3H, m, H-19), 1.47 (1H, m, H-20), 1.33 (3H, m, H-21), 2.38 (1H, m, H-22), 1.59 (4H, m, H-23, 24), 1.61 (1H, m, H-25), 1.09 (3H, m, H-27), 3.76 (1H, m, H-2′), 3.47 (1H, m, H-3′), 3.49 (1H, m, H-4′), 3.56 (1H, m, H-5′), 4.40 (1H, m, H-6′), 3.51 (2H, m, H-7′), 2.05 (4H, m, 3′,4′,5′,7′-OH)；13C-NMR (150 MHz, CDCl3): 30.6 (C-1), 29.7 (C-2), 72.2 (C-3), 28.7 (C-4), 56.7 (C-5), 211.1 (C-6), 46.6 (C-7), 39.1 (C-8), 56.5 (C-9), 38.3 (C-10), 30.6 (C-11), 40.3 (C-12), 39.1 (C-13), 46.6 (C-14), 26.9 (C-15), 19.6 (C-16), 49.0 (C-17), 59.8 (C-18), 22.4 (C-19), 72.1 (C-20), 22.4 (C-21), 70.8 (C-22), 19.8 (C-23), 37.6 (C-24), 27.8 (C-25), 61.4 (C-26), 17.3 (C-27), 78.2 (C-2′), 69.7 (C-3′), 73.4 (C-4′), 75.7 (C-5′), 101.1 (C-6′), 61.7 (C-7′)。以上數據與文獻報道一致[15]，故鑒定化合物12為西貝母堿苷。

化合物13：淡黃色油狀物，ESI-MS/: 255 [M＋Na]+（計算值255，C13H12O4Na [M＋Na]+）。1H-NMR (600 MHz, CDCl3): 7.54 (1H, s, H-8)，6.94 (1H, s, H-1), 6.96 (1H, d,= 6.8 Hz, H-3), 6.80 (1H, d,= 6.8 Hz, H-4), 5.88 (1H, brs, -OH), 3.75 (6H, s, -OMe)；13C-NMR (150 MHz, CDCl3): 165.8 (-COOH), 148.4 (C-6), 146.2 (C-7), 144.4 (C-1), 131.2 (C-10), 126.1 (C-9), 122.6 (C-8), 115.8 (C-4), 114.5 (C-3), 114.3 (C-2), 109.7 (C-5), 55.7 (-OMe), 51.2 (-OMe)。以上數據與文獻報道一致[18]，故鑒定化合物13為6,7-二甲氧基-2-萘乙酸。

4 抗腫瘤活性篩選

采用MTT比色法測定化合物1～13的體外抑制人宮頸癌HeLa細胞[19]、結腸癌Ht-29細胞以及人惡性黑色素瘤A375細胞的活性[20]。以化合物1～13為實驗組，順鉑為陽性對照組，同時設對照組。分別稱取2 mg待測樣品，用DMSO溶液充分溶解后，配制成為40 mg/mL的母液，過濾除菌后避光保存于?20 ℃冰箱中。實驗前采用倍半稀釋法，用完全培養基將母液稀釋為實驗濃度。取對數生長期的HeLa細胞、Ht-29細胞、A375細胞，并用0.25%胰蛋白酶消化成單細胞懸液后，細胞計數，以6×104/mL的密度接種于96孔板中，并在CO2培養箱中培養24 h后給藥。對照組給予等體積的PBS。實驗組中分別加入培養基配制的不同質量濃度（0、200、400、600、800 μg/mL）待測樣品；在陽性對照組中加入不同濃度的順鉑，每個濃度設3個復孔，繼續培養48 h，在避光條件下，加入5 mg/mL的MTT溶液（10 μL/孔），在培養箱中再培養4 h，棄上清后加入DMSO溶液100 μL/孔。放置于搖床上震蕩5～10 min，使結晶充分溶解后，并于酶聯免疫檢測儀570 nm波長處檢測吸光度（），根據值計算半數抑制濃度（IC50），見表1。結果顯示化合物3和11對HeLa、A375細胞具有一定的體外抑制作用，化合物8對HeLa細胞的抑制作用較弱，但對A375細胞的抑制作用較強，化合物12對HeLa、Ht-29細胞的抑制作用較弱，化合物10對HeLa、Ht-29和A375細胞的具有一定抑制作用。

5 討論

多項研究表明伊犁貝母具有抗腫瘤活性，Shen等[21]運用色譜技術結合波譜技術從伊犁貝母中分離鑒定出了對HeLa細胞具有良好抑制作用的活性成分，其IC50值為5.1～75.8 μmol/L。本實驗從伊犁貝母中分離鑒定出了13個化合物，根據已有對貝母屬中抗腫瘤活性物質的研究，對13個化合物進行了體外抗腫瘤活性實驗。結果表明，化合物10對HeLa細胞、Ht-29細胞以及A375細胞均具有良好的抑制活性，說明伊犁貝母的抗腫瘤活性具有巨大的開發潛力[22]，對進一步研究抗腫瘤新藥提供了一定的幫助。

表1 化合物3、8、10～12分別對HeLa、Ht-29、A375細胞的抑制作用

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 張亞山, 宮喜臣. 伊犁貝母的栽培技術 [J]. 特種經濟動植物, 2002, 5(6): 26-27.

[2] 陳梅花, 王慧春, 朱艷媚, 等. 貝母的藥理研究 [J]. 安徽農學通報, 2007, 13(1): 103-105.

[3] 中國藥典 [S]. 一部. 2015: 141-142.

[4] Li S L, Li P, Lin G,. Simultaneous determination of seven major isosteroidal alkaloids in bulbs ofby gas chromatography [J]., 2000, 873(2): 221-228.

[5] 伊江蘭, 麥迪尼亞提. 伊貝母總生物堿的研究概述 [J]. 新疆中醫藥, 2002, 20(4): 77-79.

[6] 徐惠波, 孫曉波, 溫富春. 伊犁貝母和梭砂貝母生理活性的初步比較 [J]. 中國中藥雜志, 2000, 25(7): 391.

[7] Wu Y B, Su J, Guo R X,. Two new non-taxoids from leaves of[J]., 2014, 50(4): 603-605.

[8] 王萍, 許靜, 王琪, 等. 黑刺菝葜根莖中苯丙素和二苯乙烯類化學成分的研究 [J]. 中國中藥雜志, 2013, 38(10): 1531-1535.

[9] 李浩華, 周燕燕, 陳玉嬋, 等. 紫玉盤內生真菌節菱孢中1個新的異香豆素類化合物[J]. 中草藥, 2016, 47(3): 369-373.

[10] 劉海濱, 高昊, 王乃利, 等. 紅樹林真菌草酸青霉(092007)的環二肽類成分 [J]. 沈陽藥科大學學報, 2007, 24(8): 474-478.

[11] 沈小玲, 曾惠芳, 陳珍, 等. 山橘的化學成分研究 [J]. 中國藥學雜志, 2002, 37(1): 14-17.

[12] 楊新洲, 呂靜南, 郝吉, 等. 昆蟲共生真菌BM2的代謝產物及其抗肝癌活性研究 [J]. 中南民族大學學報: 自然科學版, 2016, 35(3): 42-47.

[13] Zhang W, Chen W, Wang Y,. Studies on the structure of two new glycosides from. [J]., 2000, 9(3): 122-124.

[14] 尹田鵬, 陳陽, 舒燕, 等. 玉龍烏頭的化學成分研究 [J]. 云南大學學報: 自然科學版, 2018, 40(1): 148-153.

[15] 曹新偉. 川貝母的化學成分研究與貝母屬藥用植物質量評價[D]. 北京: 中國協和醫科大學, 2008.

[16] 柳慶龍, 陳阿虹, 唐進英, 等. 膽木枝葉的化學成分研究[J]. 中草藥, 2017, 48(1): 52-57.

[17] 于洋, 王建華, 方圣濤, 等. 污損生物膜細菌YT1305-1的鑒定及其代謝物化學成分分析 [J]. 微生物學通報, 2014, 41(7): 1278-1286.

[18] 沈嵐, 蔣思萍, 朱華結. 藏波羅花化學成分的研究 [J]. 天然產物研究與開發, 2012, 24(9): 1210-1213.

[19] 王曉娟, 謝謙, 劉楊, 等. 土家族藥物扣子七中三萜皂苷成分及抗腫瘤活性研究 [J]. 中草藥, 2020, 51(7): 1831-1838.

[20] 彭文文, 劉欣媛, 曾廣智, 等. 小葉臭黃皮咔唑生物堿化學成分及其抗腫瘤活性研究 [J]. 中草藥, 2016, 47(6): 886-890.

[21] Shen S, Li G, Huang J,. Steroidal saponins fromSchrenk [J]., 2012, 83(4): 785-794.

[22] 于立堅, 馬潤娣, 于廷曦. 土貝母苷甲和苷乙的抗腫瘤作用 [J]. 中國新藥雜志, 2002, 11(9): 692-694.

Chemical constituents fromand their antitumor activities

JIN Yue-xian1, 2, WEI Hong-yan2, Ma Xiao-ling2, CHEN Gang2, SHI Lei-ling2, ZHANG Jing1

1. College of Chinese Medicinal Materials, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China 2. Xinjiang Institute of Chinese and Ethnic Medicine, Urumqi 830002, China

To study the chemical constituents fromand their antitumor activities.Separation and purification of 95% ethanol extract ofwere carried out by using silica gel column, gel column and pre-HPLC and other chromatographic techniques, using NMR, MS, and other spectral techniques combined with physical and chemical properties were used for structural identification;tumor cell inhibitory activities of constituents to cervical cancer cells (HeLa), colon cancer cells (Ht-29) and human malignant melanoma cells (A375) were evaluated.Thirteen chemical constituents, including 1--feruloylglycerol (1), 4-hydroxybenzaldehyde (2), cyclo()-pro-()-phe (3), vanillic acid (4), 2-hydroxy-3-phenylpropanoic acid methyl ester (5), erigeside II (6), methyl cinnamate (7), imperialine (8), ethyl 3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)acrylate (9), peimisine (10), cyclo(pro-gly) (11), sipeimine-3β--glucoside (12), and 6,7-dimethoxynaphthalene-2-carboxylic acid (13) were isolated from.Compounds 1—7, 9, 11, and 13 are isolated fromfor the first time. And compounds 3, 8, 10—12 exhibit inhibitory activity against the tested cell lines. The IC50of compound 10 to the tested cell lines were 22.07, 52.47, and 48.27 μmoL/L, respectively.

Schrenk; alkaloids; antitumor activity; erigeside II; imperialine; peimisine; sipeimine-3β--glucoside

R284.1

A

0253 - 2670(2021)06 - 1562 - 06

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.06.003

2020-07-12

2018年中醫藥公共衛生服務補助專項“全國中藥資源普查項目”（財社［2018］43號）；國家中醫藥管理局全國中藥資源普查項目（GZY-KJS-2018-004）

金悅仙，碩士研究生，從事天然產物化學研究。E-mail: jyx0107@126.com

石磊嶺，副研究員，從事天然產物化學研究。E-mail: shileiling@sina.com

張 晶，博士生導師，教授，從事天然產物化學研究。E-mail: zhjing0701@163.com

[責任編輯 王文倩]