p38-MAPK介導(dǎo)AT2R對(duì)低氧/復(fù)氧損傷后PC12細(xì)胞的保護(hù)作用研究*

羅 敏,劉雅婷,龍雙漣,彭鳳玲,4△

(1.南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院麻醉科,湖南衡陽 421001；2.南華大學(xué)衡陽醫(yī)學(xué)院應(yīng)用解剖與生殖醫(yī)學(xué)研究所組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室,湖南衡陽 421001；3.南華大學(xué)衡陽醫(yī)學(xué)院2017級(jí)卓越醫(yī)師班,湖南衡陽 421001；4.南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,湖南衡陽 421001)

缺血性腦病是最常見的腦血管疾病，臨床治療往往以重建腦血流、挽救瀕死細(xì)胞、改善神經(jīng)細(xì)胞功能為主要目的。但腦血流重建的同時(shí)也可能進(jìn)一步加重缺血區(qū)組織的病理損害，即腦缺血/再灌注損傷[1]。神經(jīng)細(xì)胞的缺氧/復(fù)氧(hypoxia/reoxygenation，H/R)損傷及缺血區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡是腦缺血/再灌注損傷的主要表現(xiàn)[2]。研究發(fā)現(xiàn)，Bax和Bcl-2分別作為促凋亡基因和抑凋亡基因在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮著重要作用[3]，缺血可抑制絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號(hào)通路，參與細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)、凋亡和增殖等過程[4]。其中p38-MAPK與神經(jīng)細(xì)胞的凋亡密切相關(guān)，調(diào)控p38-MAPK信號(hào)途徑可明顯改善大鼠腦缺血造成的神經(jīng)損傷[5-6]。

血管緊張素Ⅱ型受體(angiotensin Ⅱ type 2 receptor，AT2R)是腎素-血管緊張素系統(tǒng)中主要活性分子之一。韓素芳[7]分析認(rèn)為AT2R與血管緊張素Ⅱ相互作用后對(duì)缺血性腦損傷起保護(hù)作用，但具體機(jī)制仍不清楚。因此，本研究用化學(xué)性缺氧劑連二亞硫酸鈉(Na2S2O4)處理大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤(pheochromocytoma-derived cell line-12，PC12)細(xì)胞以復(fù)制H/R損傷的細(xì)胞模型，采用抑制劑、激活劑干預(yù)p38-MAPK信號(hào)分子，觀察Bax和Bcl-2表達(dá)變化，以探討AT2R活化影響H/R損傷PC12細(xì)胞存活的可能分子機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

PC12細(xì)胞株(受贈(zèng)于南華大學(xué)神經(jīng)科學(xué)研究所)；四氮唑鹽(MTT，北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)；2×Taq PCR Mastermix(上海市碧云天生物技術(shù)有限公司)，F(xiàn)astQuant cDNA第一鏈合成試劑盒(長(zhǎng)沙市佳和生物科技有限責(zé)任公司)，Bax、Bcl-2和GAPDH引物(上海生工生物工程有限公司)，p38-MAPK抗體、磷酸化p38-MAPK(p-p38-MAPK)抗體(美國(guó)Cell Signaling Technology公司)，GAPDH、Bax及Bcl-2抗體(美國(guó)Biosharp公司)，AT2R抑制劑PD123319(美國(guó)Abcam公司)，AT2R激動(dòng)劑CGP42112和p38-MAPK抑制劑SB203580(美國(guó)Sigma公司)，GAPDH(美國(guó)CST公司)，高糖DMEM培養(yǎng)基和無糖DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Solarbio公司)，胎牛血清(杭州四季青生物工程材料責(zé)任有限公司)；其他試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1H/R損傷PC12細(xì)胞模型的建立及實(shí)驗(yàn)分組

PC12細(xì)胞置于含10%胎牛血清的高糖DMEM完全培養(yǎng)基中，于5% CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，棄培養(yǎng)液，以無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次，加入新鮮配制含40 mmol/L Na2S2O4的無糖無血清DMEM培養(yǎng)基中孵育，1 h后取出細(xì)胞，用無菌PBS洗3次，加入新鮮含10% 胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，再置入5% CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育1 h，復(fù)制H/R損傷細(xì)胞模型。

將H/R損傷PC12模型細(xì)胞分為4組：對(duì)照組(僅Na2S2O4處理)、CGP42112組(Na2S2O4+1×10-6mol/L CGP42112共處理)、SB203580組(Na2S2O4+1×10-6mol/L SB203580共處理)和CGP42112+SB203580組(Na2S2O4+1×10-6mol/L CGP42112+1×10-6mol/L SB203580共處理)。此外，分別以CGP42112和PD123319處理細(xì)胞，觀察其作用的濃度和時(shí)間效應(yīng)。

1.2.2MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞存活率

細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，40 mmol/L Na2S2O4處理細(xì)胞1 h，加MTT(20 μL 5 g/L)，繼續(xù)孵育4 h，棄孔內(nèi)液體后收獲細(xì)胞，每孔加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)，振蕩混勻10 min以溶解結(jié)晶物，經(jīng)全自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定各孔的吸光度(A值，波長(zhǎng)為490 nm)，取均值計(jì)算不同藥物濃度和作用時(shí)間的生長(zhǎng)抑制率。設(shè)定對(duì)照組A值代表的細(xì)胞存活率為100%，按以下公式計(jì)算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率(%)=(實(shí)驗(yàn)孔A值—調(diào)零孔A值)/(對(duì)照組A值—調(diào)零孔A值)×100%。

1.2.3臺(tái)盼藍(lán)染色觀察細(xì)胞活力

細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，經(jīng)相應(yīng)處理后以無菌PBS洗滌3次，加入約100 μL 0.4%的臺(tái)盼藍(lán)，靜置染色3 min，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。死亡細(xì)胞常被染成藍(lán)色，活細(xì)胞則拒染呈無色透明狀。

1.2.4Western blot

收集細(xì)胞提取蛋白質(zhì)樣品，10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE，積層膠60 mV，分離膠120 mV)后電轉(zhuǎn)移(100 mA，2 h)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜。5%的牛奶封閉2 h后，依次孵育一抗和二抗，用高靈敏度化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒顯色，凝膠成像系統(tǒng)采集圖像并進(jìn)行半定量分析。

1.2.5逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)

采用TRIzoL試劑常規(guī)提取細(xì)胞總RNA，按試劑盒說明，序列合成cDNA并進(jìn)行PCR。產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，以天能凝膠成像系統(tǒng)采集圖像并進(jìn)行半定量分析。實(shí)驗(yàn)中使用的引物序列見表1。

表1 引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 CGP42112和SB203580對(duì)H/R損傷PC12細(xì)胞存活的影響

與對(duì)照組比較，CGP42112組、SB203580組和CGP42112+SB203580組PC12細(xì)胞存活率升高，且CGP42112+SB203580組存活率高最高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。

a：P<0.05，與CGP42112組、SB203580組比較；b：P<0.05，與對(duì)照組比較。

2.2 CGP42112和PD123319對(duì)H/R損傷PC12細(xì)胞p38-MAPK磷酸化的影響

CGP42112可下調(diào)細(xì)胞p-p38-MAPK蛋白表達(dá)，且隨著CGP42112濃度升高和處理時(shí)間延長(zhǎng)，p-p38-MAPK蛋白表達(dá)水平均逐漸降低，見圖2。

A：不同濃度CGP42112對(duì)p-p38-MAPK蛋白表達(dá)的影響；B：1×10-6 mol/L CGP42112處理不同時(shí)間對(duì)p-p38-MAPK蛋白表達(dá)的影響；a：P<0.05，與對(duì)照組比較。

PD123319可上調(diào)H/R損傷PC12細(xì)胞的p-p38-MAPK蛋白表達(dá)，且隨著PD123319濃度升高和處理時(shí)間延長(zhǎng)，p-p38-MAPK蛋白表達(dá)水平逐漸升高，見圖3。臺(tái)盼藍(lán)染色法發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，PD123319處理細(xì)胞后顯微鏡視野下被染成藍(lán)色的死亡細(xì)胞數(shù)量增多，且隨著PD123319濃度升高，死亡細(xì)胞數(shù)量逐漸增多，見圖4。

A：不同濃度PD123319對(duì)p-p38-MAPK蛋白表達(dá)的影響；B：1×10-6 mol/L PD123319處理不同時(shí)間對(duì)p-p38-MAPK蛋白表達(dá)的影響；a：P<0.05，與對(duì)照組比較。

圖4 臺(tái)盼藍(lán)染色觀察PD123319對(duì)H/R損傷PC12細(xì)胞活力的影響(10×20)

2.3 CGP42112和SB203580對(duì)H/R損傷PC12細(xì)胞Bax、Bcl-2 mRNA及Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，CGP42112組、SB203580組和CGP42112+SB203580組Bax mRNA表達(dá)水平降低，Bcl-2 mRNA表達(dá)水平升高，且CGP42112+SB203580組Bax mRNA表達(dá)水平最低，Bcl-2 mRNA表達(dá)水平最高，見圖5。

A：H/R損傷PC12細(xì)胞中Bax mRNA的表達(dá)；B：H/R損傷PC12細(xì)胞中Bcl-2 mRNA的表達(dá)；C：Bax和Bcl-2 mRNA表達(dá)的灰度分析；a：P<0.05，與GP42112組、SB203580組比較；b：P<0.05，與對(duì)照組比較。

與對(duì)照組比較，CGP42112組、SB203580組和CGP42112+SB203580組Bax蛋白表達(dá)水平降低，Bcl-2蛋白表達(dá)水平升高，且CGP42112+SB203580組Bax蛋白表達(dá)水平更低，Bcl-2蛋白表達(dá)水平更高，見圖6。

A：H/R損傷PC12細(xì)胞中Bax和Bcl-2蛋白的表達(dá)；B：Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)的灰度分析；a：P<0.05，與CGP42112組、SB203580組比較；b：P<0.05，與對(duì)照組比較。

3 討 論

MAPK是細(xì)胞內(nèi)重要的蛋白激酶之一，其介導(dǎo)的信號(hào)通路可以將胞外刺激信息傳導(dǎo)至胞核內(nèi)，調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，從而參與細(xì)胞的生物學(xué)功能[8]。p38-MAPK是MAPK家族中的重要成員，它與應(yīng)激反應(yīng)、腦缺血等病理?xiàng)l件下所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，抑制MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路介導(dǎo)的炎性反應(yīng)，可減少缺血引起的腦損傷[9]，p38-MAPK在缺氧缺糖預(yù)處理后的神經(jīng)損傷中也起著重要的作用[10]。

PC12細(xì)胞是大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞株，它在形態(tài)和功能上與神經(jīng)細(xì)胞類似，常作為體外細(xì)胞模型被廣泛應(yīng)用于神經(jīng)細(xì)胞分化和凋亡等方面的研究[2]。神經(jīng)細(xì)胞的H/R損傷是腦缺血/再灌注損傷的主要表現(xiàn)之一，因此，本研究中以PC12細(xì)胞為研究對(duì)象，以化學(xué)性缺氧劑Na2S2O4模擬細(xì)胞缺氧反應(yīng)環(huán)境，復(fù)制H/R損傷細(xì)胞模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)p38-MAPK特異性抑制劑SB203580能誘導(dǎo)H/R損傷PC12細(xì)胞的存活，提示抑制p38-MAPK可以減輕H/R所導(dǎo)致的PC12細(xì)胞損傷。

AT2R是腎素血管緊張素系統(tǒng)中的一種G蛋白偶聯(lián)受體，它在大腦發(fā)育、腦缺血及高血壓發(fā)病過程中有重要作用[11-12]。研究發(fā)現(xiàn)，AT2R與AngⅡ相互作用后可舒張血管、調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育、促進(jìn)細(xì)胞增殖和分化、參與組織結(jié)構(gòu)的修復(fù)和重塑，還可以促進(jìn)側(cè)支循環(huán)開放、改善腦血液循環(huán)、影響炎性因子分泌，保護(hù)缺血性腦損傷的組織和細(xì)胞[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，AT2R激動(dòng)劑CGP42112可促進(jìn)Na2S2O4誘導(dǎo)的H/R損傷PC12細(xì)胞的存活，且與p38-MAPK特異性抑制劑具有協(xié)同作用，提示p38-MAPK信號(hào)通路參與了AT2R活化影響H/R損傷PC12細(xì)胞存活的作用。

磷酸化的MAPK是發(fā)揮其生物學(xué)作用的有效形式[14]。因此，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)磷酸化MAPK的水平可反映MAPK的活性。本研究采用AT2R激動(dòng)劑CGP42112處理H/R損傷PC12模型細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，CGP42112可下調(diào)細(xì)胞p-p38-MAPK蛋白的表達(dá)。相反，AT2R抑制劑PD123319則上調(diào)該模型細(xì)胞的p-p38-MAPK蛋白的表達(dá)，抑制細(xì)胞的存活，提示AT2R活化可抑制p38-MAPK蛋白磷酸化，這也是AT2R活化減輕H/R致PC12細(xì)胞損傷的機(jī)制之一。

Bax是促凋亡基因，Bcl-2則為抑凋亡基因，兩者在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮著重要作用[3]。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，在缺血性腦血管疾病中誘導(dǎo)Bcl-2/Bax表達(dá)比值增大，則可抑制缺血所誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡，提示Bax和Bcl-2之間的平衡或比值的變化在腦缺血神經(jīng)元的凋亡過程中有著十分重要的作用[15-17]。本研究中，p38-MAPK特異性抑制劑SB203580和AT2R激動(dòng)劑CGP42112均能下調(diào)H/R損傷PC12細(xì)胞Bax的表達(dá)，上調(diào)Bcl-2的表達(dá)，從而增大細(xì)胞內(nèi)Bcl-2/Bax表達(dá)比值，這提示AT2R活化可減輕H/R所致的PC12細(xì)胞損傷，其機(jī)制可能是通過抑制細(xì)胞p38-MAPK蛋白磷酸化，影響細(xì)胞內(nèi)Bcl-2/Bax表達(dá)比值，從而抑制PC12細(xì)胞的凋亡。

綜上所述，腦血管疾病以顱內(nèi)血液循環(huán)障礙導(dǎo)致腦組織損傷為特點(diǎn)，主要病理過程涉及缺血再灌注損傷后造成的神經(jīng)細(xì)胞凋亡，但其機(jī)制尚未完全闡明。本研究以H/R損傷的PC12細(xì)胞為研究模型，探討AT2R活化影響H/R損傷PC12細(xì)胞存活的機(jī)制，發(fā)現(xiàn)AT2R活化可抑制細(xì)胞p38-MAPK蛋白磷酸化，增高Bcl-2/Bax的表達(dá)比值，提示AT2R活化是通過調(diào)控p38-MAPK信號(hào)通路而影響B(tài)cl-2、Bax的表達(dá)，從而保護(hù)H/R損傷的PC12細(xì)胞，增加其存活率。