正交法優化產甲烷混合菌超低溫保護劑

譚凱麗，趙 晗

（1.煤與煤層氣共采國家重點實驗室，山西 晉城 048000；2.易安藍焰煤與煤層氣共采技術有限責任公司，山西 晉城 048000）

近年來，煤炭生物轉化技術逐漸受到重視，國內外諸多學者陸續開展了煤炭生物成氣的相關研究[1-3]，并在實驗室條件下以煤為底物，通過接種高效產甲烷混合菌群進行模擬成氣實驗，獲得良好的產甲烷效果[4-5]。在實驗室環境下進行煤炭生物氣化實驗時，菌群結構穩定、產甲烷效果良好的混合菌對煤炭生物氣化實驗起著關鍵作用[6]。目前，微生物菌種的保藏多為單菌種的保藏，關于混合菌群的保藏鮮見報道。而根據經典厭氧發酵理論[7-8]，參與到產甲烷氣過程中的微生物主要為水解發酵型細菌、產氫產酸菌及產甲烷菌，這些混合菌共同作用于煤基質而產生生物煤層氣。曾有學者對山西寺河礦區121 煤層氣井產出水樣中的菌群進行保藏實驗，得出菌群保藏的最佳條件為25 ℃下的煤基-基礎鹽配方，此方法保藏的產甲烷菌群能長期維持在較高的活性狀態，保持較好的產甲烷能力[9]。

微生物菌種保藏方法很多，冷凍干燥保存法和冷凍保存法是目前公認的長期保存微生物菌種的最安全、可靠的方法。其中冷凍保存法中的液氮超低溫保存法適用范圍廣，可用于大多數微生物，特別是不適合用冷凍干燥保存法保存的微生物，因此該方法已經成為長期保存微生物菌種的最佳方法[10]。許多研究表明[11]，在低溫保藏細胞和組織時，添加保護劑比不添加保護劑的保藏效果更好。適當濃度的保護劑進入細胞內可避免細胞膜冷凍損傷，添加了保護劑的菌種冷凍后，可以保持較高的存活率[12]。

海藻糖、甘油、二甲基亞砜作為常用的保護劑，在低溫生物醫學領域被廣泛使用[13]。根據保護劑在深低溫保存中的作用可以分為兩大類：滲透性和非滲透性保護劑。其中二甲基亞砜和甘油為滲透性保護劑，海藻糖為非滲透性保護劑。滲透性保護劑多屬于低分子中性物質，在溶液中優先同水分子相結合，增加溶液的黏性，弱化水的結晶過程，達到保護的目的。非滲透性保護劑通常分子量較小，能溶于水，但不能進入細胞，在降溫時主要與滲透性保護劑聯合使用，促使細胞完成脫水，同時還具有中和滲透性保護劑毒性的作用。

本文采用正交實驗設計法，選用L9（34）正交表，以產甲烷混合菌群為實驗對象，海藻糖、甘油和二甲基亞砜作為保護劑，優化了超低溫保藏產甲烷混合菌群保護劑配比。

1 實 驗

1.1 實驗材料

菌種來源于山西沁水某煤層氣井，通過收集煤層氣井口排采水獲得含有產甲烷菌群水樣，將水樣裝入厭氧瓶后，放入冰塊帶回實驗室。采集來的水樣添加產甲烷培養基和無煙煤煤塊后放入200 L 厭氧發酵罐中，在35 ℃富集培養，定期排掉菌液后添加同等體積新鮮培養基[14]。保藏實驗進行前，菌液在發酵罐內穩定產氣，甲烷體積分數維持在15%左右。

培養基采用無菌無氧產甲烷培養基：在1 L 去離子水中，依次加入磷酸二氫鉀1.5 g、磷酸氫二鉀2.9 g、氯化銨0.4 g、氯化鎂1.8 g 和酵母抽提物2.0 g，在電爐上加熱至沸騰，冷卻后加入半胱氨酸，調節pH 值至7，加入質量分數1%刃天青，裝上定量分液器后通氮氣，加熱培養基至沸騰、無色，在微沸狀態下煮15 min～30 min，在通氮氣的情況下冷卻，定量分裝到厭氧瓶內，用鋁蓋封口后高溫滅菌備用。

保護劑：海藻糖、甘油、二甲基亞砜。

1.2 實驗方法

1.2.1 正交實驗設計

為得到最佳產甲烷混合菌群保護劑配比，以海藻糖、甘油、二甲基亞砜作為研究對象，選用L9（34）正交表進行正交實驗，因素水平表見表1。

表1 因素水平%

1.2.2 產甲烷混合菌的培養及收集

實驗進行前，將發酵罐內50 mL 混合菌液接入250 mL無菌無氧的產甲烷培養基內混合均勻，于500 mL 厭氧瓶中35 ℃恒溫培養。產甲烷混合菌的生長情況以600 nm 處的光密度值（OD600）評價。定期檢測轉接菌液實驗組及空白對照組OD600值。產甲烷混合菌轉接后OD600值變化圖見圖1。由圖1 可知，菌液轉接至500 mL厭氧瓶24 h 后，OD600值有下降趨勢，因此，產甲烷混合菌在接種24 h 后，進行產甲烷混合菌的保藏實驗。

圖1 產甲烷混合菌轉接后OD600 值變化圖

1.2.3 產甲烷混合菌的保藏實驗

按照實驗設計進行正交實驗，將培養24 h 的混合菌液置入厭氧工作站（英國DWS DG1000）中，通過注射器接入事先通氮氣除氧的離心管，擰緊瓶蓋后10 000 r/min 離心20 min，再次放入厭氧工作站中，棄上清液，按照相應濃度加入保護劑后放入耐低溫凍存管，進行液氮超低溫保藏。

1.2.4 存活率的測定

將存有產甲烷混合菌的凍存管在液氮中保藏48 h后，室溫下靜置2 h，用血球計數板計數并計算存活率，存活率計算公式見式（1）：

1.2.5 產甲烷濃度測定

將計數后菌液按照組別，以體積比1∶5 接入無菌無氧培養基中，35 ℃恒溫培養，7 d 后測定甲烷體積分數。

2 結果與分析

2.1 因素指標分析

正交設計及數據和正交實驗結果分別見表2、表3。

表2 正交設計及數據

表3 正交實驗結果

從表3 實驗結果可知：對于存活率，因素主次關系為甘油質量分數＞二甲基亞砜質量分數＞海藻糖質量分數，保護劑最佳組合為質量分數10%甘油+ 質量分數 7%二甲基亞砜 + 質量分數 10%海藻糖（B2C2A1）。對于產甲烷體積分數，因素主次關系為二甲基亞砜質量分數＞甘油質量分數＞海藻糖質量分數，保護劑最佳組合為質量分數3%二甲基亞砜+ 質量分數6%甘油+質量分數10%海藻糖（C3B1A1）。

這是因為煤的厭氧生物降解需要不同代謝功能的多種微生物菌群相互配合來完成，在進行冷凍保藏的過程中，不同的菌群對于低溫、氧氣的適應性也不盡相同，產甲烷菌為一種嚴格的專性厭氧微生物，對氧氣敏感度較高，而其他微生物均為兼性厭氧微生物，可承受一定濃度范圍的氧氣。有研究表明[15]，作為保護劑，甘油對特定類型細胞非常有效，而二甲基亞砜使用更為廣泛，對所有的細胞類型都很有效。但本實驗結果顯示，甘油保護劑的添加，對整體菌群存活率有所提高，二甲基亞砜則更利于產甲烷菌的存活。

2.2 方差分析

冷凍保護劑方差分析結果見表4 和表5。表4 和表5 表明，3 種保護劑對冷凍存活率及產甲烷的影響均不顯著。

表4 冷凍保護劑方差分析結果（存活率）

表5 冷凍保護劑方差分析結果（甲烷體積分數）

2.3 最優化結果驗證

以產甲烷體積分數作為最終參考指標，進行驗證實驗，結果見表6。

表6 驗證實驗結果

以C3B1A1（質量分數3%二甲基亞砜+ 質量分數6%甘油+ 質量分數10%海藻糖）為產甲烷混合菌保護劑，進行低溫冷凍保藏，活化后其產甲烷體積分數達到了13.05%。

3 結 論

添加了保護劑的實驗組經液氮超低溫保藏后，其產甲烷能力優于不添加任何保護劑的實驗組。產甲烷混合菌未加保護劑實驗組在直接冷凍的情況下，其存活率為13.04%，且產氣實驗后甲烷體積分數偏低；而添加了保護劑的實驗組其存活率為39.13%，并且產氣實驗后甲烷體積分數相對較高（13.05%），是不添加保護劑的對照組（0.41%）的32 倍。