分光光度法測定茶葉中總黃酮含量

王麗麗，林清霞，宋振碩，陳 林

(福建省農業科學院茶葉研究所，福建 福州 350013)

黃酮類化合物廣泛存在于植物中，是重要的次生代謝產物之一。由于最先發現的黃酮類化合物都具有一個酮式羰基結構，又呈黃色或淡黃色，故稱黃酮。黃酮類可看作是2-苯基色原酮的一系列衍生物，根據中央三碳鏈的氧化程度、三碳鏈是否成環，B環連接位置可分為黃酮類和黃酮醇類、二氫黃酮類和二氫黃酮醇類、查爾酮類、雙黃酮類、異黃酮類以及其他黃酮類[1]。茶多酚是一類存在于茶樹[Camelliasinensis(L.) O. Kuntze]中的多元酚混合物，包括兒茶素類；黃酮、黃酮醇；花青素、花白素類；酚酸及縮酚酸等[2]。其中的兒茶素類屬黃烷-3-醇類，其含量約占茶多酚含量的70%，是茶葉中的特征性物質和功能活性物質，具有苦澀味，與茶湯濃度與滋味成正相關。茶葉中的黃酮類包括黃酮、黃酮醇及其苷類，其中黃酮醇C3位糖苷化后具有柔和感澀味(干燥的口感)，對茶湯中咖啡堿的苦味有增強作用，且對茶湯色澤有一定影響[3]。黃酮類和兒茶素類與茶葉感官品質密切相關，而且具有諸多共同的生物活性，如抗氧化、抗衰老、鎮靜催眠、降血脂、降血壓、護肝保肝、預防心腦血管疾病等[1-2,4]，因此受到研究人員的廣泛關注。

茶葉中黃酮類測定常采用三氯化鋁顯色法[5]，反應原理是茶樣待測液與三價鋁鹽絡合后顯黃色。出境茶葉等植物源食品中黃酮類測定采用硝酸鋁顯色法[6]，利用的是待測液與鋁鹽在弱堿性條件生成黃色絡合物的原理。茶湯本底色澤尤其是綠茶、白茶和清香型烏龍茶的水提液顏色也顯黃(綠)色，故對上述顯色法產生一定干擾，導致測定值偏高。亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色法已用于測定檀香、柑橘醋、棗等多種植物中總黃酮含量[7-10]，但該法并不是黃酮類的專屬反應，凡具有鄰苯二羥基的物質均能用此法顯色測定[6]，因此測得的茶葉中總黃酮包括黃酮類和兒茶素類等。本試驗用70%甲醇提取茶樣，經亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉溶液顯色后生成紅色絡合物，于510 nm波長處測定吸光度，從而建立茶葉中總黃酮含量的分光光度法，并從精密度、準確性、穩定性、加標回收率等方面進行方法學考察。采用已建立的亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色法測定綠茶、白茶、烏龍茶、紅茶等4個茶類15個茶樣中總黃酮的含量。本試驗建立了一種快速、較為準確的用于茶葉中包括黃酮類和兒茶素在內的總黃酮含量的測定方法，以期對茶葉感官品質與功能活性評價提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

綠茶樣(G1～G3)、烏龍茶樣(O1～O3)和紅茶樣(B1～B3)各3個，白茶樣(W1～W6)共6個，總計15個，生產年份均為2019年，市售，見表1。

表1 茶樣說明Table 1 Relevant information on sampled teas

1.2 試劑與儀器

試劑：甲醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉和三氯化鋁(上海國藥，分析純)；蘆丁對照品[(成都曼思特生物科技有限公司，純度98%(UV)]；兒茶素(美國Sigma公司，純度>98%)；沒食子酸[阿拉丁(試劑)上海有限公司，純度>98%)]；福林酚試劑(北京索寶來)。

儀器：Varioskan LUX多功能酶標儀(美國Thermo Scientific)、ACD-502-U實驗室超純水機(重慶頤陽)、HWS24型電熱恒溫水浴鍋(上海一恒)、普通96孔酶標板(常德比克曼生物)等。

1.3 試驗方法

1.3.1 茶樣供試液制備 稱取磨碎茶樣0.2 g，加入70%甲醇10 mL，70℃水浴提取20 min，期間振蕩1次。靜置30 min后轉移至10 mL容量瓶，定容。再轉移至離心管內，4000 rpm離心10 min，取上清，即得供試液。

1.3.2 亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色法測定總黃酮含量 參照張公亮[12]建立的方法，稍有改動。取上述供試液1 mL于50 mL離心管中，加入5% 亞硝酸鈉 0.5 mL，搖勻，靜置6 min。然后加入10% 硝酸鋁 0.5 mL，搖勻，靜置6 min。最后加入4% 氫氧化鈉 4 mL，搖勻，靜置15 min。準確移取200 μL至96孔板內，設3個復孔，采用酶標儀于510 nm波長下測吸光度，以70%甲醇作空白對照。

1.3.3方法學考察 分別從線性關系、精密度、重復性、穩定性和加標回收率等方面對1.3.2項下已建立的方法進行方法學考察。(1)線性試驗：準確稱取蘆丁10 mg，用70%甲醇定容至10 mL容量瓶內，超聲混勻，制得1 mg·mL-1儲備液。然后進行系列稀釋后，制得0.2、0.4、0.5、0.6、0.8 mg·mL-1對照品溶液。取蘆丁對照品溶液1 mL，按1.3.2項下方法測定。以濃度(mg·mL-1)為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線，得到線性回歸方程。(2)精密度試驗：取W2磨碎茶樣0.2 g，按1.3.1項下方法制備供試液，按1.3.2項下方法顯色，96孔板中每孔加200 μL，設5個復孔，測定吸光度，計算RSD。(3)重復性試驗：取W2磨碎茶樣0.2 g，按1.3.1項下方法制備供試液，平行制備6份，其余同1.3.2項下操作，測定吸光度，計算RSD。(4)穩定性試驗：將W2磨碎茶樣按1.3.1項下方法制備供試液，依1.3.2項下方法顯色。分別于顯色后的0、15、30、45、60、90 min時測定吸光度，計算RSD。(5)加標回收率試驗：W2茶樣按上述方法制備供試液，用純水按一定比例稀釋后作為待測液，按上述方法顯色后測定其吸光度，計算總黃酮含量(mg·mL-1)；同時取已知質量濃度的蘆丁對照品溶液適量，加入待測液中，并控制其終體積為1 mL，顯色后測定其吸光度，計算總黃酮含量；上述兩者差值的絕對值即為總黃酮增加量(mg·mL-1)。總黃酮增加量與加入蘆丁濃度的比值即為加標回收率。各回收率取平均值，計算RSD。

1.3.4 茶樣測定 分別準確稱取15個茶樣磨碎樣0.2 g，按1.3.1項下方法制備供試液，用純水按1:5稀釋后作為待測液。取待測液1 mL，依1.3.2項下方法顯色，測定吸光度，代入線性回歸方程，得出總黃酮含量(%)。采用福林酚比色法[13]測定15個茶樣的茶多酚含量。

1.3.5 數據處理 所有數據采用Excel 2010和SPSS 21.0軟件進行整理分析。表格和圖制作采用Excel 2010軟件，采用SPSS 21.0軟件進行雙變量相關性分析。

2 結果與分析

2.1 茶葉中幾種化合物與亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉的顯色反應特性

試驗比較了蘆丁、兒茶素與沒食子酸等對照品與亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉溶液反應后的顏色差異。從圖1看出，蘆丁和兒茶素與亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色后均呈(鮮)紅色，W2茶樣與其顯色后為橙紅色，而沒食子酸顯色后為黃色。說明蘆丁和兒茶素結構中的相同部位與亞硝酸鈉-硝酸鋁溶液發生了絡合反應，當加入4%氫氧化鈉后，絡合產物開環生成了2’-羥基查爾酮，從而使得兩者顯色一致，而沒食子酸與之反應后未生成此物質。W2茶樣中含有的兒茶素類、黃酮類等組分與之反應后也呈橙紅色。因此采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色法測得的茶葉總黃酮包括黃酮類與兒茶素類。

圖1 不同樣品與亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉的絡合顯色情況Fig.1 Colorization of tea methanol extracts reacted with NaNO2-Al(NO3)3-NaOH solution注：所用蘆丁、兒茶素和沒食子酸對照品溶液的質量濃度依次為：0.3、0.5、1.0 mg·mL-1，茶樣為W2待測液。

2.2 方法學考察

以質量濃度0.2、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0 mg·mL-1為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線，得到線性回歸方程為Y=1.2465X+0.0074，相關系數為0.9997。由此表明蘆丁對照品在0.2～1.0 mg·mL-1質量濃度范圍內呈良好線性關系，結果見圖2。

圖2 蘆丁對照品溶液的標準曲線Fig.2 Standard curve of rudin solutions

精密度試驗表明，W2茶樣按1.3.1項下方法制備供試液，按1.3.2項下方法顯色后，測定吸光度，其吸光度的平均值為1.20，平均含量為0.95 mg·mL-1，RSD為0.94%。說明儀器精密度良好。重復性試驗表明，W2茶樣按上述方法制備供試液，平行制備6份，其余操作不變，測得6份供試液的平均吸光度為1.22，平均含量為0.98 mg·mL-1，RSD為2.92%，說明該方法重復性好。穩定性試驗表明，W2茶樣依上述方法顯色后，0、15、30、45、60、90 min時測定吸光度依次為1.19、1.16、1.14、1.10、1.09、1.02，平均含量為0.89 mg·mL-1，RSD為4.82%。樣品顯色后在90 min 內穩定，表明該方法穩定性良好。以上結果見表2。回收率試驗結果如表3所示，各加標回收率為81.58%、83.04%、86.23%、80.95%、82.36%、91.95%。其平均值為84.35%，RSD為4.15%。

表2 精密度、重復性和穩定性試驗結果Table 2 Precision, repeatability, and stability of proposed method

表 3 加標回收率試驗結果Table 3 Recovery rates of proposed method on spiked standards

2.3 茶樣總黃酮含量測定

15個茶樣分別采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色法、福林酚比色法測定總黃酮和茶多酚含量，結果見圖3。從圖3可知，15個茶樣總黃酮含量范圍為5%～10%，平均值為8.22%，其中綠茶、白茶含量最高，烏龍茶次之，紅茶最低，推測含量大小主要與發酵程度有關。紅茶為全發酵茶，發酵程度高于其他茶類，因此測得總黃酮含量相對較低。W6系白茶中的壽眉等級，采用嫩梢或葉片制成，采摘原料相對白毫銀針、白牡丹等級較老，故其在6個白茶樣中含量也最低，僅為7.60%。測得茶多酚的含量范圍為7%～16%，平均值11.94%，與總黃酮含量規律表現基本一致，即：綠茶、白茶>烏龍茶>紅茶。雙變量相關性分析顯示，15個茶樣總黃酮含量與茶多酚含量呈極顯著正相關，Pearson相關系數達0.874。由此推測，茶葉中的總黃酮是茶多酚的主要組成物質。

圖3 茶樣中總黃酮和茶多酚含量Fig.3 Contents of total flavonoids and tea polyphenols in teas as determined by different methods

3 討論與結論

蘆丁是黃酮醇化合物槲皮素的蕓香糖苷，是一種從植物中提取的黃酮類化合物。該化學物難溶于冷水，可溶于甲醇、乙醇等有機溶劑。因此本試驗參考《GB/T 8313-2018 茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》中茶多酚含量測定采用的提取溶劑，即用70%甲醇提取茶樣，目的是使茶樣中的總黃酮充分浸出。魯翠濤等[14]研究表明，50%～75%濃度的甲醇對千層塔干葉中總黃酮含量的提取率較高。

蘆丁是測定植物總黃酮含量常用的標準物質，在鐵觀音和云南普洱茶中也被檢測到[15-16]。亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色法原理是先用亞硝酸鈉還原黃酮，再加硝酸鋁絡合，最后加氫氧化鈉溶液使黃酮類化合物開環，生成2’-羥基查耳酮而顯色。根據顯色之深淺(即吸光度值之大小)，判斷總黃酮含量之高低。本試驗表明，茶葉中的兒茶素與亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉溶液反應后生成2’-羥基查耳酮而顯紅色，但沒食子酸與之反應后未生成此物質，這與郭亞健等[17]研究結果一致，由此說明該顯色法測定的總黃酮包括黃酮類和兒茶素類，但不含沒食子酸。沒食子酸常作為福林酚比色法中測定茶多酚總量的標準物質[18]，原理是利用福林酚試劑氧化茶多酚中-OH基團并顯藍色，于765 nm測定吸光度，用沒食子酸作校正標曲定量茶多酚。15個茶樣中總黃酮含量為5%～10%，茶多酚含量7%～16%，二者呈極顯著正相關，由此推測，采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色法測得的總黃酮與茶多酚之間具有密切相關性，茶葉的總黃酮是茶多酚的主要組成部分。

研究顯示，不同顯色方法適用于不同植物中黃酮類測定。田金河等[19]采用光譜掃描，三氯化鋁顯色、硝酸鋁顯色的方法分別測定綠豆殼中黃酮物質的特征吸收峰，結果表明，采用低濃度三氯化鋁顯色的方法最適合綠豆殼中黃酮含量的測定。鐘世安等[5]采用三氯化鋁、硝酸鋁和氫氧化鉀作為顯色劑，對柚皮提取物中黃酮的特征吸收峰進行測定比較，認為硝酸鋁和氫氧化鉀顯色法適合測定柚皮提取物中黃酮含量。普洱茶固態發酵過程中兒茶素含量有明顯降低，茶黃素和茶紅素的含量也不高，到壓制成成品茶時達到最低，因此郭剛軍等[18]認為，普洱茶固態發酵樣與原料樣黃酮總量測定宜采用三氯化鋁法，而成品茶樣則宜采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色法。總之，三氯化鋁顯色法對黃酮類化合物的專屬性較強，可用于茶葉黃酮類測定，但顯色不穩定，且存在茶湯背景色干擾；而亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色法較為穩定，與茶葉中的黃酮類和兒茶素等均能絡合顯色，因此可測定二者總含量。然而該法回收率偏低，郭麗冰等[20]研究表明，以蘆丁為對照品，采用同樣方法測定降香總黃酮含量，加樣回收率低，為78.49%，可能原因是降香提取液在可見光下呈現深紅色，干擾測定結果，嘗試扣除背景后，結果仍不理想。降香中不含蘆丁，以降香中分離得到的一個含量較高的黃酮即柚皮素為對照品，與甲醇鈉顯色后測定410 nm吸光度，能較好的測定總黃酮含量，平均加標回收率為100.46%。我們試驗發現，茶湯稀釋液在510 nm幾乎無吸收，可忽略背景色干擾。在一定濃度范圍內，茶湯稀釋液和蘆丁經顯色后吸光度與其總黃酮含量分別呈線性關系，但茶湯與蘆丁混合后顯色不具有線性疊加特點，因此回收率結果不理想(偏低)，推測可能的原因是茶湯中如兒茶素類物質與亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉發生反應后，其顯色程度(紅色深淺)與蘆丁顯色程度不一致，可考慮嘗試不同對照品測定茶葉中總黃酮含量。

本試驗以蘆丁為對照品，采用70%甲醇提取茶樣，經亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉溶液顯色后，于510 nm測定吸光度，從而建立了測定茶葉中總黃酮(包括黃酮類和兒茶素類)含量的分光光度法。該方法操作簡便，精密度、重復性與穩定性好，可作為茶葉總黃酮含量測定的一種方法，用于茶葉品質與活性評價。