青蝦紅肢病的病原鑒定及治療研究

顧雪林，田丹陽，魏 賓，周曉東，鈕 靜，張茂友，宋學宏

(1.蘇州市吳中區水產技術推廣站，江蘇 蘇州 215104；2.蘇州大學，江蘇 蘇州 215123；3.蘇州市水產技術推廣站，江蘇 蘇州 215006)

青蝦因生長快、病害少、養殖成本低、經濟效益穩定而受廣大養殖戶的喜愛，成為江蘇省主推的水產養殖品種，其養殖面積及產量穩中有升。但近年來養殖者反映青蝦也出現散發性死亡，附肢與身體發紅，有時死亡率達30%～40%。青蝦紅肢病也稱紅體病、紅頭病、紅體綜合征，4－11 月是該病的流行季節，發病高峰為6－9 月，發病率為40%～60%，死亡率為15%～40%。2020 年8 月蘇州市吳中區稻蝦綜合種養基地發生了紅肢病，青蝦出現零星死亡。抽樣檢查發現，附近70%的池塘發病，發病池中有10%～30%的青蝦身體顏色變深，有的蝦游泳足變為紅色、腹部和尾扇微紅、鰓部顏色變淺、肝區形狀模糊、腸道無食、活力差，死亡率為10%～15%。本文對該蝦病的病原進行了分離鑒定并開展了藥敏試驗，以期為生產上有效防控該病提供科學依據。

一、材料與分析

1.試驗用青蝦來源 病蝦與健康試驗蝦分別來自蘇州市吳中區稻蝦綜合種養基地的發病田與另一個未發病養殖戶的青蝦池塘。病蝦規格為(2.32±0.74)克，健康蝦規格為(2.13±1.03)克。

2.病原菌分離與純化 取具典型紅肢癥狀的患病青蝦浸泡于75%的酒精中1 分鐘，用無菌鑷子打開病蝦頭部，取出肝胰腺至1 毫升LB 液體培養基中，連續吹打5次后100倍稀釋，取50微升稀釋液涂布平板，37℃培養過夜。再將分離到的細菌進行純培養，用pH 7.2 的PBS 洗滌菌苔并稀釋至2×104CFU/毫升，4℃保存用于后續的攻毒試驗與分類鑒定。

3.病原菌的攻毒試驗 將購回的健康蝦放在圓形養殖桶(直徑30 厘米、高40 厘米)曝氣暫養1周后，取無病活潑的健康蝦隨機分入養殖桶，每桶6只，進行感染攻毒試驗。在試驗蝦的第3肌節注射待檢菌液20 微升/只，即4×102CFU/尾，對照組注射無菌生理鹽水，劑量同試驗組。每組設3個平行，飼養水溫26℃，pH 7.8，觀察青蝦的發病情況，統計死亡數。

4.病原菌的分類鑒定 將分離純化的細菌28℃培養24 小時后進行革蘭氏染色和形態觀察，純培養物采用BBL Crystal微生物鑒定系統進行初步分類鑒定。然后委托金唯智生物科技有限公司進行細菌16S rDNA 測序，測序拼接的16S rDNA 基因序列的可變區V3～V4 片段經NCBI GeneBank 數據庫進行Blast比對、構建分枝系統樹，確認所分離細菌的分類地位。

5.藥物敏感試驗 采用動物用藥敏分析試劑板(南京菲恩醫療科技有限公司)對分離的細菌純培養物進行藥物敏感試驗。檢測細菌對恩諾沙星、氟苯尼考、硫酸新霉素、甲砜霉素、氟甲喹、鹽酸多西環素、磺胺間甲氧嘧啶鈉、磺胺甲唑＋甲氧芐啶等8種藥物的敏感性。

6.發病蝦的藥物治療 在病原體檢驗與藥敏試驗的同時對青蝦進行了治療，采用拌料口服鹽酸多西環素1 克/千克飼料，連續5 天，全池潑灑苯扎溴銨1.5 克/米3兩次，隔天1 次，同時潑灑1.5克/米3的過硫酸氫鉀復合物進行改底。

二、結果與分析

1.病原菌的致病力 檢查發現，病蝦的游泳足變為紅色、腹部和尾扇微紅、鰓部顏色變淺、肝區形狀模糊、腸道無食、活力差，病蝦癥狀見圖1A。從病蝦肝胰腺中分離到兩種菌，分別記作qx8151 和 qx8152，在水溫 26℃、pH 7.8 的水環境條件下，將兩株純培養物分別以4×102CFU/尾的劑量攻毒后，qx8151 菌組在24 小時游泳足、腹部和尾扇呈紅色，以及鰓部顏色變淺的典型癥狀，50% 以 上 死 亡 ， 至 48 小 時 死 亡 率 為 100% ；qx8152 菌感染后蝦體色略顯深灰色，在24 小時也出現少量死亡，死亡率為16.7%，到48小時死亡率為16.7%～33.3%，感染后發病癥狀見圖1B～圖1E。T 檢驗結果發現，空白組與生理鹽水組無差異；qx8152 菌株組與生理鹽水組也無顯著差異，與空白組有差異(P＜0.05)，與qx8151菌組差異極顯著(P＜0.01)；qx8151 菌組與所有組的差異均極顯著(P＜0.01)(表1)。上述結果說明，qx8151 菌株的致病性非常強，qx8152 菌株的致病性遠小于qx8151菌株，qx8152菌應為條件致病菌。

圖1 發病的蝦與致病菌感染后蝦的發病癥狀

2.病原菌分類鑒定 從病蝦肝胰腺中分離出的兩種菌落qx8151 和qx8152，其中qx8151 的菌落小、圓形、邊緣光整，培養24小時后的直徑達1.0毫米左右，菌落呈乳白色半透明；菌落數占所有菌落的90%以上，細菌革蘭氏染色陰性，彎桿狀。qx8152 的菌落較qx8151 大、圓形、微凸、邊緣整齊、表面光滑，培養24 小時后菌落直徑達1.5～2.0 毫米，淺黃色半透明，菌落數占10%左右，革蘭氏染色陰性，形狀短桿狀。

兩株菌的純培養物經BBL Crystal 微生物鑒定系統初步分類鑒定，結果顯示菌株qx8151 與擬態弧菌(Vibrio mimicus)的相似度最高，可信度值為97.01%；菌株qx8152 與嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)的相似度最高，可信度值為99.83%。兩株純培養物分離測序的16S rRNA基因通過Blast檢索系統進行序列比對的結果顯示，菌株qx8151 與擬態弧菌及霍亂弧菌的同源性最高，與擬態弧菌聚為1支；菌株qx8152與嗜水氣單胞菌的同源性最高。綜上所述，菌株qx8151 為擬態弧菌，菌株qx8152為嗜水氣單胞菌。

3.藥物敏感性與治療效果 藥敏試驗檢測擬態弧菌與嗜水氣單胞菌對8種抗生素的敏感性，結果如表2～表4 所示，擬態弧菌對恩諾沙星、鹽酸多西環素、氟甲喹的敏感性較強，0.10微克/毫升就能抑制擬態弧菌；磺胺間甲氧嘧啶鈉、磺胺甲唑＋甲氧芐啶基本無效。嗜水氣單胞菌對這8 種抗生素的敏感性明顯小于擬態弧菌，只有0.78微克/毫升濃度的恩諾沙星、硫酸新霉素、甲砜霉素能抑制嗜水氣單胞菌，其他抗生素基本無效，可能嗜水氣單胞菌對這些抗生素產生了抗性。

采取連續拌料口服鹽酸多西環素藥餌5天，全池潑灑苯扎溴銨、過硫酸氫鉀復合物改底等治療方案對發病池塘的青蝦進行了治療，結果在第3天青蝦就從每畝死亡幾百尾下降至10 多尾，第4 天停止死亡，取得了預期的治療效果。

表1 病蝦分離菌的純培養物致病率

表2 擬態弧菌與嗜水氣單胞菌的藥物敏感性

表3 菌株對磺胺間甲氧嘧啶鈉藥物敏感性

表4 菌株對磺胺甲唑＋甲氧芐啶的藥物敏感性

表4 菌株對磺胺甲唑＋甲氧芐啶的藥物敏感性

擬態弧菌 嗜水氣單胞菌藥物濃度(微克/毫升)16/3.2＋8/1.6＋4/0.8＋2/0.4＋1/0.2＋藥物濃度(微克/毫升)16/3.2＋8/1.6＋4/0.8＋2/0.4＋1/0.2＋

三、結論

1.病原菌的致病性較強 青蝦紅肢病或紅體病是近年來青蝦養殖中常發的疾病，發病季節是5－10 月，本次分離到的qx8151 菌株為擬態弧菌，菌落特征與生化檢定結果與葉雪平等(2002)描述的一致，4×102CFU/尾的接種量在48 小時青蝦全部死亡，其致死濃度遠低于青蝦980910株(葉雪平等分離)的攻毒濃度(5×104CFU/尾)，毒力較強。qx8152 菌株為嗜水氣單胞菌，用4×102CFU/尾的攻毒量，青蝦48小時的平均死亡率為27.3%，致病力相對較弱。

2.治療方案 藥敏試驗結果說明，目前稻蝦田塊和池塘中的強毒株擬態弧菌對恩諾沙星、鹽酸多西環素、氟甲喹敏感，弱毒株嗜水氣單胞菌對恩諾沙星、硫酸新霉素、甲砜霉素較敏感。根據體內外同時進行治療策略以及治療初步效果，建議用以下方法進行綜合治療，即采用拌料口服鹽酸多西環素1 克/千克飼料，連續5 天，全池潑灑苯扎溴銨1.5 克/米3兩次，隔天1 次，同時潑灑1.5克/米3的過硫酸氫鉀復合物進行改底。