松郁安神方對(duì)失眠大鼠基底核多巴胺和腺苷含量的影響

王秀峰 張瑜 曾雪愛(ài) 張一帆 黃俊山

(福建省中醫(yī)藥科學(xué)院，福州，350003)

失眠是睡眠障礙最常見的一種疾病，以睡眠時(shí)間不足或睡眠質(zhì)量下降為特征，以入睡困難、易醒或醒后難以入睡為常見表現(xiàn)，臨床上失眠患者數(shù)量呈現(xiàn)逐年增長(zhǎng)趨勢(shì)，長(zhǎng)期的失眠會(huì)嚴(yán)重影響工作和生活[1]。中醫(yī)許多學(xué)者認(rèn)為失眠的病機(jī)當(dāng)以肝郁為首[2]，故治療失眠應(yīng)以著重調(diào)理肝的功能為基礎(chǔ)，即遵照中醫(yī)的治則應(yīng)該予以疏肝解郁安神之法。松郁安神方(SYF)是黃俊山教授臨床上使用疏肝安神法治療失眠的經(jīng)驗(yàn)方，療效確切，不良反應(yīng)小。但是，SYF治療失眠的藥理機(jī)制還不是很明確，本研究通過(guò)失眠大鼠模型，給予SYF和西藥治療，以大鼠基底核組織中多巴胺和腺苷含量變化為切入點(diǎn)，探討松SYF防治失眠的作用機(jī)制，為豐富疏肝安神法治療失眠提供部分實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)選用SPF級(jí)Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠60只，體質(zhì)量(220±10)g，由上海斯萊實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(滬)2017-0005，質(zhì)量合格證號(hào)：20170005004461，飼養(yǎng)于福建省中醫(yī)藥科學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，恒溫(22±1)℃和12 h:12 h固定照明節(jié)律(08:00開燈)的環(huán)境下，并可自由攝取食物和水。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 中藥復(fù)方SYF由甘松10 g、郁金15 g、玫瑰花10 g、酸棗仁15 g、夜交藤30 g、生龍骨30 g(先煎)、珍珠母30 g(先煎)、丹參15 g組成[3]。中藥飲片購(gòu)于鷺燕(福建)藥業(yè)股份有限公司。以上藥物一次性煎煮，分裝后-20 ℃保存?zhèn)溆谩４笫笥昧繛槌扇?倍(按體質(zhì)量計(jì)算)劑量，按15 mL/kg灌胃給藥，1次/d，給藥時(shí)間1周[4]。阿普唑侖片(批號(hào)：20190417)，購(gòu)于福建省第二人民醫(yī)院。

1.3 主要試劑和儀器 Rat DA ELISA Kit(貨號(hào)：ml003201)和Rat Adenosine ELISA Kit(貨號(hào)：ml058881-C)購(gòu)于mlbio公司。對(duì)氯苯丙氨酸(PCPA)(貨號(hào)：C6506-25G)購(gòu)于Sigma公司。酶標(biāo)儀(美國(guó)BioTek，800TS)。

1.4 失眠大鼠模型的建立 PCPA按300 mg/kg溶于弱堿性生理鹽水中，配制成混懸液，連續(xù)腹腔注射PCPA2d，建立大鼠失眠模型。實(shí)驗(yàn)大鼠出現(xiàn)晝夜節(jié)律消失，白天活動(dòng)增多，睡眠減少直至消失，進(jìn)食及飲水增多等整體觀察與正常組有明顯不同表明造模成功[5]。

1.5 實(shí)驗(yàn)大鼠的分組、給藥及取材 造模成功后分成以下幾組：對(duì)照組、模型組、SYF低劑量組、SYF高劑量組和西藥阿普唑侖組，每組大鼠12只。SYF低劑量組按8.5 g/kg灌胃給藥，1次/d，1周；SYF高劑量組按17 g/kg灌胃給藥，1次/d，1周。阿普唑侖用蒸餾水配制成混懸液，用量為0.04 mg/kg，灌胃給藥，1次/d，1周。對(duì)照組和模型組給予同等體積的生理鹽水灌胃，1次/d，共7 d。以上各組，均按15 mL/kg體質(zhì)量灌胃。

實(shí)驗(yàn)結(jié)束，將實(shí)驗(yàn)大鼠用戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉(40 mg/kg)，腹主動(dòng)脈取血5 mL裝到抗凝管中，離心取上清，分裝EP管中凍存?zhèn)溆?。取血后，斷頭，剪開頭皮，用血管鉗揭去顱骨和硬腦膜，剪斷雙側(cè)視神經(jīng)后用眼科鑷子迅速取出大鼠的整個(gè)腦組織。用0.9%氯化鈉溶液沖洗干凈，置于液氮或-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 神經(jīng)遞質(zhì)的檢測(cè) 神經(jīng)遞質(zhì)的檢測(cè)方法按照Rat DA ELISA Kit和Rat Adenosine ELISA Kit檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。取所需檢測(cè)的大鼠血漿樣本各50 μL，不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品各50 μL分別加入96孔酶標(biāo)板中。標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的檢測(cè)抗體100 μL，封板，37 ℃溫育60 min。然后洗板5次。每孔加入底物A、B各50 μL，37 ℃避光孵育15 min。每孔加入終止液50 μL，15 min內(nèi)，450 nm測(cè)OD值，計(jì)算樣本的濃度。

2 結(jié)果

2.1 用藥前后實(shí)驗(yàn)大鼠的一般情況差異 實(shí)驗(yàn)期間對(duì)照組的大鼠，飲食沒(méi)有明顯的變化，體質(zhì)量緩慢增加，睡眠活動(dòng)正常，毛色有光澤，其他生理狀況正常。在造模和用藥期間，模型組大鼠的飲食增加，白天和夜間活動(dòng)比對(duì)照組增加，睡眠減少，精神狀態(tài)差，煩躁，皮毛顏色欠光澤，體質(zhì)量增長(zhǎng)與對(duì)照組和觀察組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。中藥復(fù)方SYF在改善失眠引起的癥狀上優(yōu)于西藥阿普唑侖。

2.2 不同藥物處理對(duì)大鼠基底核組織中DA含量的影響 為了檢測(cè)不同藥物對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠基底核組織中DA含量的影響，采用Rat DA ELISA Kit檢測(cè)用藥處理后各組大鼠基底核組織中DA含量。結(jié)果如圖1所示，與對(duì)照組大鼠基底核組織中DA含量比較，模型組大鼠基底核組織中DA含量顯著升高(P<0.01)，阿普唑侖組大鼠基底核組織中DA含量顯著降低(P<0.01)。與模型組比較，阿普唑侖組、SYF高劑量組和SYF低劑量組大鼠基底核組織中DA含量均顯著下降(P<0.01)。同阿普唑侖組比較，SYF高劑量組(P<0.05)和SYF低劑量組(P<0.01)比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。SYF高劑量組和SYF低劑量組之間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖1 各組實(shí)驗(yàn)大鼠基底核組織中DA含量比較

2.3 不同藥物處理對(duì)大鼠基底核組織中腺苷含量的影響 同樣，我們采用了Rat Adenosine ELISA Kit檢測(cè)了用藥處理后各組大鼠基底核組織中腺苷含量。結(jié)果如圖2所示，與對(duì)照組大鼠基底核組織中腺苷含量比較，模型組大鼠基底核組織中腺苷含量顯著降低(P<0.01)，阿普唑侖組和SYF高劑量組大鼠基底核組織中腺苷含量顯著升高(P<0.01)。與模型組比較，阿普唑侖組、SYF高劑量組和SYF低劑量組大鼠基底核組織中腺苷含量均顯著上升(P<0.01)。同阿普唑侖組比較，SYF高劑量組和低劑量組基底核組織中腺苷含量比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。SYF高劑量組和SYF低劑量組之間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖2 各組實(shí)驗(yàn)大鼠基底核中腺苷含量比較

3 討論

目前，各種社會(huì)因素造成了失眠人群的不斷增長(zhǎng)，長(zhǎng)期失眠則會(huì)嚴(yán)重影響生命質(zhì)量。長(zhǎng)期失眠患者病程較長(zhǎng)，易反復(fù)發(fā)作，難以速愈。臨床缺乏理想的治療失眠的藥物，中醫(yī)藥治療失眠目前也取得了很大的進(jìn)步，療效好，不良反應(yīng)小的優(yōu)勢(shì)得到了一定的認(rèn)可[6]。本研究也發(fā)現(xiàn)了，中藥復(fù)方SYF在改善由失眠引起的癥狀上比西藥阿普唑侖效果好，這也就證實(shí)了中醫(yī)藥治療失眠的優(yōu)勢(shì)。因此，研究中醫(yī)藥防治失眠，揭示其藥理作用機(jī)制具有一定的科學(xué)意義。

近幾年來(lái)，越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)證實(shí)基底核(Basal Ganglia，BG)在睡眠與覺(jué)醒的轉(zhuǎn)換中起著重要的作用。基底核由紋狀體、蒼白球、丘腦底核和黑質(zhì)4個(gè)主要的核團(tuán)組成，它們?cè)谒吲c覺(jué)醒的調(diào)節(jié)中又各自起著不同的作用。腺苷A1受體或A2A受體分別與多巴胺D1受體或D2受體在基底核中呈現(xiàn)高表達(dá)[7]。多巴胺是腦內(nèi)含量最多的對(duì)維持覺(jué)醒起著重要調(diào)節(jié)作用的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)[8]。DA能神經(jīng)元與睡眠、覺(jué)醒腦區(qū)間存在廣泛的纖維聯(lián)系，提示DA系統(tǒng)可能參與了睡眠——覺(jué)醒的調(diào)控[9]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，破壞中腦黑質(zhì)的DA系統(tǒng)后，動(dòng)物在行為上不能表現(xiàn)為覺(jué)醒，但在腦電圖上呈現(xiàn)出明顯的覺(jué)醒狀態(tài)的快波。精神運(yùn)動(dòng)興奮藥如哌醋甲酯，可引起覺(jué)醒延長(zhǎng)并產(chǎn)生強(qiáng)烈的代償性睡眠反彈[10]。腺苷是研究發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的內(nèi)源性促睡眠物質(zhì)之一，腺苷及其受體作為鎮(zhèn)靜催眠的新靶點(diǎn)具有誘人的前景。腺苷水平變化與睡眠呈顯著地正相關(guān)，與代謝產(chǎn)物穩(wěn)態(tài)平衡調(diào)節(jié)睡眠的理論一致。在睡眠剝奪時(shí)腦內(nèi)腺苷水平下降，睡眠恢復(fù)時(shí)腺苷水平增高[11]。

本研究發(fā)現(xiàn)，同對(duì)照組比較，失眠模型組大鼠基底核組織中的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)DA含量顯著的增加。給予模型大鼠中藥復(fù)方SYF治療能夠顯著性的抑制DA的釋放作用，使DA恢復(fù)到正常水平。同對(duì)照組比較，失眠模型組大鼠基底核組織中的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)腺苷含量顯著的降低，給予模型大鼠中藥復(fù)方SYF治療能夠顯著性的增加腺苷的釋放作用，使腺苷恢復(fù)到正常水平。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果部分證實(shí)了，中藥復(fù)方SYF在改善由失眠引起的癥狀方面效果是優(yōu)于西藥阿普唑侖的。睡眠剝奪可以造成的失眠模型大鼠基底核組織中神經(jīng)遞質(zhì)DA和腺苷的調(diào)節(jié)失控。給予中藥復(fù)方SYF治療后，失眠大鼠基底核組織中神經(jīng)遞質(zhì)DA和腺苷含量回歸到正常水平，表明了疏肝安神法防治失眠的作用機(jī)制可能與調(diào)控基底核中DA和腺苷釋放途徑相關(guān)。

綜上所述，疏肝安神的中藥復(fù)方松郁安神方能夠通過(guò)調(diào)節(jié)基底核中DA和腺苷釋放，達(dá)到治療失眠的目的。關(guān)于疏肝安神類中藥如何調(diào)控基底核中DA和腺苷釋放防治失眠的機(jī)制還需要更深入的研究去證實(shí)。