外周血Th1、Th17細胞比值與布氏桿菌性脊柱炎術后復發的相關性

賈永利，楊新明，張培楠，孟憲勇，胡長波

布氏桿菌性脊柱炎是由布氏桿菌侵襲脊柱引發椎體或椎間盤炎性反應改變的一種感染性疾病[1]。臨床病理特征為肉芽腫性炎[2]。其最先累及軟骨組織，繼而累及椎間盤，引起骨質破壞和椎間盤形態改變，最終導致椎間盤發生功能及形態的改變[3]。布氏桿菌性脊柱炎的發病機制尚不明確，但有研究發現，機體免疫功能可能與脊柱炎的發生發展密切相關；CD4+T細胞包括Th1細胞、Th17細胞等，是機體免疫應答的重要部分[4]。Th17細胞是產生白介素-17(IL-17)等細胞因子的輔助性T細胞，IL-17可誘導炎性細胞因子產生并導致組織器官發生炎性損傷和組織損傷[5]。目前，Th1、Th17細胞在布氏桿菌性脊柱炎中的作用尚不清楚?，F分析布氏桿菌性脊柱炎患者外周血中Th1、Th17細胞比值水平，并從免疫學角度為布氏桿菌性脊柱炎發病機制及臨床診斷提供理論依據，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2017年1月—2020年3月河北北方學院附屬第一醫院骨外科收治布氏桿菌性脊柱炎患者68例作為研究對象(脊柱炎組)，男44例，女24例，年齡42～70(56.94±7.78)歲；病程3～26(6.18±1.14)個月；感染原因：因飼養、放牧而受污染30例，接觸病畜的尿糞及其污染物15例，飲用未經消毒乳制品或吃生羊肉11例，處理病畜生產而受污染8例，屠宰病畜或分離內臟而受污染4例；發病部位：1個椎體受累8例，2個椎體受累37例，3個椎體受累23例；病灶部位腰椎多于胸椎。選取同期醫院體檢健康者70例為健康對照組，男44例，女26例，年齡42～70(57.64±8.28)歲。2組性別、年齡比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究通過醫院倫理委員會批準，研究對象知情同意并簽署知情同意書。

1.2 病例選擇標準 (1)納入標準：①以腰腿痛為主要癥狀就診；②磁共振成像檢查發現脊柱存在感染性病變；③經血清學或病理活檢，確診感染菌為布氏桿菌；④病例資料齊全，術后同意接受隨訪。(2)排除標準：①近6個月使用糖皮質激素等激素類藥物；②合并其他類型自身免疫性疾病(如類風濕性關節炎等)；③妊娠期或哺乳期女性；④合并慢性炎性反應疾??；⑤合并嚴重肝、腎功能異常。(3)布氏桿菌感染診斷標準[6]：①有明確的流行病學接觸史(如家畜、野生動物)；②實驗室虎紅平板凝集實驗結果為陽性；③細菌學培養結果為陽性。

1.3 觀測指標與方法

1.3.1 Th1和Th17細胞百分比率檢測：患者于術前及術后3 d、體檢者當日清晨空腹采集肘靜脈血5～6 ml，平均分成2份，一份置于普通采血管中，4℃離心留取上清，凍存于-80℃冰箱中，待測；另一份置于含乙二胺四酸二鉀采血管中，-80℃冰箱保存。上述直接凍存的靜脈血解凍，離心分離出上層血漿，向試管中加入等體積的PBS稀釋液，再加入淋巴細胞分離液，繼續梯度離心，獲取外周血單核細胞。加入藻紅蛋白(PE)標記的CD8單抗20 μl和PE-Cy5標記的CD3單抗10 μl，4℃避光孵育20 min，加入溶血素1 ml，室溫靜置15 min，離心棄上清后，PBS清洗1次。加入破膜劑500 μl，離心棄上清后進行胞內細胞因子染色;然后加入IFN-γ(FITC標記)抗體和IL-17A(FITC標記)進行胞漿染色，4℃避光溫育20 min，PBS清洗1次，重懸細胞，置于Accurl C6型流式細胞儀(美國BD公司)中檢測分析Th1、Th17細胞比例，CD3+CD8-IFN-γ+即為Th1細胞，CD3+CD8-IL-17+即為Th17細胞。

1.3.2 血清炎性因子檢測：取上述凍存血清解凍。采用酶聯免疫吸附測定法(ELISA)測定血清白介素-2(IL-2)、干擾素-γ(IFN-γ)、IL-17、IL-23、IL-6；IL-2、IL-6 ELISA試劑盒購自(上海晶抗生物工程有限公司)，IFN-γ ELISA試劑盒購自(上海廣銳生物科技有限公司)，IL-17 ELISA試劑盒購自(北京百奧萊博科技有限公司)，IL-23 ELISA試劑盒購自(南京賽泓瑞生物科技有限公司)。均嚴格參照操作說明書進行。

1.3.3 隨訪：術后對布氏桿菌性脊柱炎患者隨訪3個月，根據患者恢復情況分為未復發亞組60例和復發亞組8例。

2 結 果

2.1 2組術前外周血單核細胞Th1、Th17細胞百分率比較 與健康對照組比較，脊柱炎組患者外周血單核細胞Th17細胞比例升高，Th1細胞比例降低(P均<0.01)，見表1。

表1 2組術前外周血單核細胞Th1、Th17細胞比較

2.2 2組術前血清炎性因子比較 與健康對照組比較，脊柱炎組患者血清IL-17、IL-6、IL-23水平升高，IL-2、IFN-γ水平降低(P均<0.01)，見表2。

表2 2組術前血清炎性因子水平比較

2.3 脊柱炎患者2亞組外周血單核細胞Th1、Th17細胞百分率比較 與未復發亞組比較，復發亞組患者術后外周血單核細胞Th17細胞比例升高，Th1細胞比例降低(P均<0.01)，見表3。

表3 術后2亞組外周血單核細胞Th1、Th17細胞比較

2.4 脊柱炎患者2亞組血清炎性因子水平比較 與未復發亞組比較，復發亞組患者術后血清IL-17、IL-6、IL-23水平升高，IL-2、IFN-γ水平降低(P均<0.01)，見表4。

表4 術后2亞組血清炎性因子水平比較

2.5 影響布氏桿菌性脊柱炎術后復發因素分析 以布氏桿菌性脊柱炎術后是否復發為因變量，術后Th1細胞百分比、Th17細胞百分比、IL-17、IL-6、IL-23、IL-2、IFN-γ為自變量，多因素Logistic回歸分析顯示，術后Th1、Th17細胞百分比及IL-17、IL-6、IL-23、IL-2、IFN-γ均是布氏桿菌性脊柱炎術后復發的危險因素，見表5。

表5 多因素Logistic回歸分析影響布氏桿菌性脊柱炎術后復發因素

3 討 論

布氏桿菌病是人畜共患的地區性流行病，屬于乙類傳染病。人類患病的主要原因是與攜帶或感染布氏桿菌的牛、豬、羊等牲畜有接觸，主要通過呼吸道、皮膚及消化道途徑進入人體，寄生在人血液中，會引發人體發熱及多器官損傷，如骨骼肌、肝臟、脾臟等，但對脊柱的損傷最為常見[7-8]。正常人脊柱布氏桿菌感染的幾率為2%～77%，多發生在50歲左右的人群中，尤其以男性患病居多，且與患者職業相關性較大[9]。本病以腰背疼痛為常見臨床癥狀，其可能原因是脊柱周圍軟組織及椎間盤的炎性反應導致脊神經受壓[10]。

檢測外周血中Th1細胞、Th17細胞數量，有助于判斷布氏桿菌性脊柱炎病情及預后評估。CD4+T細胞在機體免疫中扮演重要角色。Th1細胞可分泌促炎細胞因子IFN-γ、IL-2等參與機體細胞免疫過程。研究顯示，若Th1細胞異?；钴S，可能會引起機體組織或器官損傷，或導致自身性免疫疾病發生[11]。IFN-γ、IL-2等細胞因子可清除外來細菌和病毒，在局部炎性反應中發揮著促炎作用。IFN-γ可激活巨噬細胞，促進炎性反應，從而參與關節炎的發病過程[12]。王翠玲等[13]研究顯示，發作期的強直性脊柱炎患者外周血中Th1細胞百分比率比穩定期低，血清中IFN-γ、IL-2水平顯著降低，可能因炎性反應作用向關節內遷移導致Th1細胞向關節內轉移，從而導致外周血中Th1細胞百分比率降低。另有研究顯示，宿主(如小鼠)體內Th2細胞水平增高，從而抑制Th1細胞的免疫反應，使Th1細胞/Th2細胞失衡，也會導致布氏桿菌病發生[14]。本研究發現，脊柱炎組患者術前外周血Th1細胞比例、血清IL-2、IFN-γ水平顯著低于健康對照組，與龐盼等[15]研究結果相一致，提示Th1細胞比例可能與布氏桿菌性脊柱炎的發生有關，猜測外周血中Th1細胞比例下降可能是由于Th1細胞集中于脊關節部位，加重病情。術后復發亞組患者外周血Th1細胞比例及血清IL-2、IFN-γ水平顯著低于未復發亞組，提示Th1細胞比例變化可能與布氏桿菌性脊柱炎患者術后復發密切相關。

Th17細胞是近年研究發現的Th細胞亞群，可參與機體局部微環境炎性反應。Th17細胞可分泌IL-17、IL-6、IL-23等促炎細胞因子，介導細胞免疫反應，與組織器官特異性免疫反應發病具有密切聯系。Th17細胞與自身免疫性疾病的發生有緊密聯系，若減弱Th17細胞的分化，降低IL-17、IL-23水平，可能會減輕自身免疫性疾病病情嚴重程度[16]。IL-17可通過作用于巨噬細胞、上皮細胞等，進一步促進促炎細胞因子的表達，并募集活化的中性粒細胞遷移至炎性反應部位和組織損傷部位[17]。IL-23可刺激Th17細胞的增殖，并延長細胞的生存期[18]。有文獻報道，IL-23可通過與白介素-23受體(IL-23R)特異性結合，激活蛋白酪氨酸激酶，隨后磷酸化信號轉導子及轉錄激活子，激活IL-17的產生，IL-17、IL-23共同參與強直性脊柱炎發病機制[19-20]。孟珊等[21]研究發現，強直性脊柱炎患者外周血中Th17細胞百分比率較健康者高，且血清IL-17、IL-23、IL-6水平也顯著升高。本研究發現，脊柱炎組患者術前外周血Th17細胞比例及血清IL-17、IL-6、IL-23水平顯著高于健康對照組，提示Th17細胞比例增大可能會促進布氏桿菌性脊柱炎的發生。術后復發亞組患者外周血Th17細胞比例及血清IL-17、IL-6、IL-23水平顯著高于未復發亞組，提示Th17細胞比例及IL-17、IL-23等細胞因子水平變化可能影響布氏桿菌性脊柱炎患者術后復發，猜測Th17細胞影響術后復發可能與Th17細胞具有促炎作用有關。但當前針對布氏桿菌性脊柱炎的研究結果甚少，且納入研究對象僅有68例，可能使結果有所偏倚，對于其具體機制尚需深入探究。此外，Logistic回歸分析顯示，術后Th1細胞百分比、Th17細胞百分比、IL-17、IL-6、IL-23、IL-2、IFN-γ均是布氏桿菌性脊柱炎術后復發的危險因素，提示監測布氏桿菌性脊柱炎患者外周血Th1細胞及Th17細胞百分比，對預估患者術后是否會出現復發可能具有重大意義。

綜上所述，布氏桿菌性脊柱炎術后復發患者外周血Th17細胞百分率較高、Th1細胞百分率較低，可能參與布氏桿菌性脊柱炎患者術后復發。但本研究未深入研究Th1細胞、Th17細胞水平與布氏桿菌性脊柱炎術后復發機制的關系，后續還需進一步研究。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

賈永利：設計研究方案，實施研究過程，論文撰寫；楊新明：提出研究思路，分析試驗數據，論文審核；張培楠：實施研究過程，資料搜集整理，論文修改；孟憲勇：進行統計學分析；胡長波：課題設計，論文撰寫