脂滴在弓形蟲和艾美耳球蟲感染過程的動力學及其功能

孫 霈 ， 王超越 ， 索 勛 ， 劉賢勇

(中國農業大學動物醫學院 ， 北京 海淀 100193)

頂復門原蟲(Phylum Apicomplexa)在宿主細胞的帶蟲空泡(Parasitophorous vacuole,PV)中完成增殖分裂時需要吸收宿主的營養物質，而脂滴作為一類重要的營養來源參與宿主與病原之間的相互作用。本文以頂復門(Phylum Apicomplexa)原蟲中的龔地弓形蟲(Toxoplasmagondii)和艾美耳球蟲(Eimeriaspp.)為例，概述其在細胞內寄生時的脂滴動力學及其功能。

1 頂復門原蟲對營養物質的吸收

頂復門原蟲是一類專性胞內寄生的原蟲，包括龔地龔地弓形蟲(Toxoplasmagondii)、瘧原蟲(Plasmodium)、隱孢子蟲(Cryptosporidium)、艾美耳球蟲(Eimeria)等，能夠引起嚴重的人和動物疾病。弓形蟲是一種能夠危害人畜健康的機會性原蟲，常以假包囊(速殖子)和包囊(緩殖子)的形式寄生于幾乎所有溫血動物的有核細胞，可引起動物宿主流產以及視網膜炎癥等，并且是導致免疫功能缺陷患者死亡的主要病原體之一[1]。而目前已發現的艾美耳球蟲超過1 800種，其典型的球蟲生活史發育過程與弓形蟲相似。艾美耳球蟲感染造成的球蟲病給畜禽業造成巨大的經濟損失。弓形蟲及艾美耳球蟲一旦“主動入侵”，會在胞內建立非融合的區域，即帶蟲空泡，并在其內完成生長增殖[2-5]。

頂復門原蟲的帶蟲空泡不與宿主細胞器融合，但其所需的營養物質(如脂類物質)大多依賴于宿主細胞，而脂滴作為一類重要的營養來源參與宿主與病原之間的相互作用。關于這類寄生蟲如何攝取宿主細胞的營養物質一直是研究的熱點。目前的研究證明，頂復門原蟲具有一套復雜的內化機制用于吸收宿主細胞內包括脂滴在內的營養物質[6]。本篇綜述主要探討頂復門原蟲種的弓形蟲攝取宿主細胞脂滴內化為自身營養物質的機制，也概述宿主限制弓形蟲營養吸收的相關過程；同時還對艾美耳球蟲脂滴相關研究結果進行闡述。

2 脂滴在寄生蟲感染期間的動態變化

脂滴是一類球狀的動態且復雜的細胞器，存在于幾乎所有類型的細胞和生物體中，包括寄生蟲、白細胞以及哺乳動物體內參與免疫反應的細胞[7]。其核心由中性脂質組成，主要是甘油三酯、膽固醇磷脂；核心外由一層單層磷脂分子及各種蛋白包裹[8]。脂滴與其他細胞結構如內質網、線粒體、過氧化物酶體、核內體等相互作用，能夠調節脂質代謝，細胞信號傳導，膜運輸以及能量穩態等機體內活動；同時，脂滴活動受機體調節并可能根據刺激、細胞類型、激活狀態和炎性環境而變化[7，9-12]。

近年來，研究發現包括病毒、細菌、寄生蟲在內的一些病原微生物都能與脂滴相互作用。起初認為，病原微生物主要是利用脂滴來獲得能量及脂質等來源，而近年來研究發現，脂滴也可以在病原微生物和宿主之間發揮媒介作用[7]。

弓形蟲作為一類營養缺陷型寄生蟲，它需要吸收宿主細胞內的物質并內化為自身生長所需的營養，進而完成生命周期。而同樣在帶蟲空泡內寄生的艾美耳球蟲，也需要依賴宿主的營養物質。但帶蟲空泡膜相當于一個分子篩，只能允許小于1 300 Da的分子(如維生素、核苷酸、氨基酸以及糖類)進入，這種結構能夠直接限制寄生蟲對大分子物質的攝取[13]。寄生蟲如何內化脂滴這類分子量較大的物質？圍繞這一問題，諸多科學家進行了探究。

研究發現，寄生蟲在宿主細胞的寄生蟲帶蟲空泡中復制時，寄生蟲的增殖會誘發大量的脂滴生成[14]。弓形蟲完成復制、增殖等生命活動需要脂類物質參與，但其自身無法從頭合成膽固醇。研究發現，弓形蟲能夠將宿主脂滴內化到帶蟲空泡中，挽救脂質含量以合成自身的膜結構；或者在過量的情況下，將其存儲在蟲體自身的脂滴中以滿足自己的營養需求[9]。在弓形蟲感染期間，宿主細胞的脂滴數量會發生波動。最初，宿主細胞中的脂滴會聚集在帶蟲空泡膜附近，隨著脂滴的數量逐漸增加，其峰值出現的時間與第1輪寄生蟲復制(入侵后約8 h)有關；但寄生蟲的高復制率需要該病原體能夠從哺乳動物的內吞細胞器中高效回收這類脂質，隨感染時間的延長，脂滴逐漸從宿主細胞內消失而內化為弓形蟲體內的物質[15](圖1)。

圖1 弓形蟲感染宿主細胞期間脂滴的分布

牛艾美耳球蟲(E.bovis)體外培養時，通過免疫熒光能夠觀察到被感染的細胞內有大量的脂滴積累[16]。目前尚未觀察艾美耳球蟲感染期間脂滴的具體動態變化過程，但同屬頂復門原蟲的瘧原蟲、弓形蟲等的相關報道為后續開展艾美耳球蟲的脂滴研究工作建立了很好的平臺[17]。

3 脂滴參與代謝

脂滴不僅是甘油三酯貯存和分解、花生四烯酸代謝和前列腺素合成的主要場所,而且具有合成甘油三酯和磷脂的功能。宿主脂滴脂質含量和脂解活性對于寄生蟲在哺乳動物細胞中的發育非常重要[9，18]。

3.1 脂滴參與蟲體的脂肪酸代謝 研究顯示，脂滴為弓形蟲速殖子發育提供脂肪酸和中性脂質[13]。但弓形蟲內化宿主脂滴以及自身合成脂肪酸機制經過長期探索才得以解析。弓形蟲能夠通過多種途徑利用宿主來源的脂肪酸。其中一部分脂肪酸能夠通過脂肪酸合酶(即FASI和FASII)途徑從宿主脂滴中獲取，在感染期間截獲宿主Rab7相關的脂滴并將其以胞吞途徑捕獲到帶蟲空泡中，使它們可被寄生蟲內化吸收[7]。一旦脂滴由寄生蟲內化，該寄生蟲可以修飾宿主衍生的脂質，如膽固醇可以由2個酰基輔酶A酯化，通過膽固醇酰基轉移酶(ACAT)以存儲在胞質脂滴[15]。在龔地弓形蟲中，FASII負責合成超過80%的飽和長鏈脂肪酸(LCFA)，脂肪酸的合成和攝取對于寄生蟲的生長和發病機理具有重要作用，但由于 FASII途徑不是哺乳動物細胞脂肪酸的主要來源，因此，開展弓形蟲FASII代謝酶功能研究將為新型抗蟲藥物的研制提供理論基礎。而另一部分脂肪酸則通過內質網中的脂肪酸延伸系統(ELO)，FASII合成途徑中的一部分LCFA通過ELO途徑被合成超長鏈脂肪酸(VLCFA)前體。之后的研究也發現，弓形蟲可以利用其誘發的脂噬途徑來彌補脂肪酸的不足。

通過比較基因組發現柔嫩艾美耳球蟲基因組中有7種涉及Ⅱ型脂肪酸合成的酶；進一步利用免疫熒光以及電鏡定位柔嫩艾美耳球蟲脂肪酸生物合成酶(烯酰還原酶EtENR，Ⅱ型脂肪酸合酶的一種成分)，發現其定位于蟲體頂質體[19-20]。目前的研究表明，EtENR可能是抗球蟲藥的特異性靶標[19]。

我們通過ToxoDB數據庫比對以及查閱相關文獻，發現弓形蟲與艾美耳球蟲的脂肪酸合成途徑以及參與的相關酶相似(圖2、表1)。相關數據提示我們，未來對艾美耳球蟲脂肪酸合成及代謝的深入剖析可以參照弓形蟲已有的研究工作。

表1 弓形蟲脂肪酸合成和修飾的部分酶名稱及艾美耳球蟲基因號

圖2 龔地弓形蟲及球蟲中脂滴代謝的關鍵酶及其分布KCR:酮脂酰-CoA還原酶； HCD:羥酰-CoA還原酶； ECR:烯酰-CoA還原酶； ACP:酰基載體蛋白； KAR:酮脂酰ACP還原酶； HAD:羥酰基CoA脫氫酶； ENR:烯醇還原酶； ACBP:酰基CoA結合蛋白； PPTase:磷酸泛酰巰基乙胺基轉移酶； ATAC:膽固醇酰基轉移酶； ELO:脂肪酸延長酶； G3PAT:甘油-3-磷酸酰基轉移酶

3.2 脂滴參與蟲體的膽固醇代謝 有趣的是，不同的膽固醇營養缺陷性寄生蟲似乎遵循不同的膽固醇清除策略，調節宿主細胞膽固醇的代謝是寄生蟲特異性和/或宿主細胞特異性過程。眾所周知，龔地弓形蟲通過甲羥戊酸途徑在從頭合成膽固醇方面存在缺陷，它主要利用宿主細胞中的膽固醇(主要從低密度脂蛋白中獲取膽固醇)。在弓形蟲感染的細胞中，該過程獨立于內質網和高爾基體，并且弓形蟲內化的膽固醇能夠均勻分布在蟲體內。但當膽固醇過量時，寄生蟲利用膜相關的ABC轉運蛋白釋放膽固醇和磷脂酰膽堿。

迄今為止，還沒有針對任何艾美耳球蟲屬物種進行膽固醇獲取的詳細分析。有學者分析了牛艾美耳球蟲對內皮宿主細胞膽固醇代謝的影響，發現與其他球蟲存在顯著差異。總體而言，在牛艾美耳球蟲感染的宿主細胞中，游離膽固醇顯著積累。在對牛艾美耳球蟲的相關酶的研究中發現，最值得注意的是角鯊烯環氧酶(SQLE)的表達上調，已知其是甲羥戊酸途徑中的限制性關鍵酶之一，而且該酶也在弓形蟲感染的豬和人的宿主細胞中被誘導表達。此外，在牛艾美耳球蟲感染的內皮宿主細胞中，膽固醇穩態調節的2個關鍵分子(INSIG1和SCAP)上調表達可能指向弓形蟲中尚未描述的其他機制[21]。

有學者利用鐮形艾美耳球蟲(E.falciformis)為研究對象，利用轉基因技術以及脂質組學等研究了鐮形艾美耳球蟲的磷脂組成和脂質生物發生的酶促網絡，所述子孢子表達所有常見的甘油磷脂，如PtdCho、PtdEtn、PtdIns、PtdSer和PtdGro。鐮形艾美耳球蟲中某些脂類物質以及酶與包括弓形蟲在內的其他原蟲相似[17]。但目前尚未報道艾美耳球蟲誘導脂滴積累的細胞類型及其感染期間脂滴的動態變化等內容。

4 脂滴能夠限制寄生蟲生長

與可以在宿主細胞質中自由擴散的小分子代謝物不同，攝取宿主脂肪酸(FAs)對胞內微生物構成了獨特的挑戰，原因有2個：(1)脂肪酸大部分被隔離為膜結合的脂滴；(2)線粒體的活動能夠限制弓形蟲脂肪酸的吸收。線粒體作為真核細胞的代謝中心，其是脂滴發生β-氧化生成脂肪酸的主要位置[14]。

作為類花生酸的主要來源，脂滴參與寄生蟲誘導的炎癥調控過程。在弓形蟲感染的肌肉細胞和巨噬細胞中，脂滴的形成與COX-2和PGE2高表達相關，這可能有助于細胞分泌IL-12和干擾素IFN-γ，其中，IFN-γ對于控制弓形蟲以及其他寄生蟲的感染至關重要[7,22-23]。

有研究報道稱，作為脂類降解的主場所——線粒體在人類多種疾病中都發揮作用[24]。專性的細胞內病原體依賴于宿主細胞的營養來維持生存，限制其獲取特定營養素的能力會抑制其生長或誘發休眠狀態。形態學觀察顯示，在弓形蟲感染期間，宿主細胞線粒體會在帶蟲空泡附近伸長，而線粒體是脂滴發生β-氧化的場所，從而導致脂肪酸降解，這種途徑會大大降低弓形蟲對脂肪酸的吸收[24]。另有研究顯示，弓形蟲在自噬或甘油三酸酯貯庫基因缺陷的宿主細胞中，脂肪酸的吸收和生長受到抑制；相反，在正常的宿主細胞中，弓形蟲的脂肪酸攝取和增殖會相對增加[14]。由此我們猜測，宿主細胞可以通過影響線粒體的作用進而抑制弓形蟲的生長，但其作用機理尚不清楚。另外，可以與胞內寄生的病原體競爭營養的宿主細胞器還包括內質網以及高爾基體等，但其通過何種機制限制弓形蟲對營養物質的攝取仍是懸而未定的問題。

目前尚沒有宿主自身細胞器參與并限制艾美耳球蟲吸收及合成脂類物質進而影響其增殖的相關報道。但是通過外源加入一些能夠限制脂類物質合成的化學試劑，如SOAT，ENR抑制劑等，能夠明顯限制艾美耳球蟲在宿主細胞內的增殖[25]。

5 展望

宿主的脂滴在代謝、信號傳導等過程中起主要作用，并積極參與先天免疫應答。已有研究證實，脂滴在宿主—寄生蟲生物學中起著重要的作用，寄生蟲與宿主的相互作用調節了2種生物的脂質代謝，這些研究為細胞生物學、免疫應答和藥物開發提供了寶貴的知識。但目前脂滴的許多關鍵內容尚不清楚，例如在感染期間脂滴儲存的脂類分子如何被調控？脂滴如何與其他細胞器相互作用？宿主通過什么機制限制寄生蟲對脂類物質的攝取？所以對脂滴的深入探索，不僅能夠彌補寄生蟲的對營養內化吸收研究領域的短板，而且寄生蟲和宿主脂質代謝的潛在差異可能為新型治療藥物的研發提供有希望的靶標。