使用多重PCR檢測奶牛乳房炎乳汁中的病原菌

張玉龍 ， 左之才 ， 王 宇 ， 崔耀成 ， 李志強 ， 姚彩霞 ， 黃贊恒 ， 才冬杰

(四川農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院 環(huán)境公害與動物疾病四川省高校重點實驗室 動物疫病與人類健康四川省重點實驗室 ， 四川 雅安 625014)

奶牛乳房炎是世界上公認的尚未完全解決的奶牛疾病難題之一，是奶牛中最普遍且治療費用昂貴的疾病之一[1-2]。奶牛乳房炎難以根治的原因是該病病情易反復[3]，其病因受多因素影響，如物理性損傷、化學性刺激、機體應激性和外界病原微生物感染等[4]，而病原微生物感染而引發(fā)奶牛乳房炎占主導因素，其中重要的病原菌有金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,S.aureus)、無乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae,S.agalactiae)、綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa,P.aeruginosa)等[5-7]。

近年來，不同地域養(yǎng)殖場乳房炎的主要致病菌有所差異，且臨床型乳房炎、隱性乳房炎發(fā)病率也有差異性[8-10]。李利山等通過傳統(tǒng)細菌學方法對天津部分地區(qū)養(yǎng)殖場的奶牛隱性乳房炎進行細菌學調(diào)查，結果顯示，臨床型乳房炎乳樣中S.aureus檢出率為40.60%，S.agalactiae為3.10%；亞臨床乳房炎乳樣品中，S.aureus檢出率為44.19%[11]。張明國等對四川省攀西地區(qū)進行了奶牛乳房炎病原菌區(qū)系調(diào)查，結果發(fā)現(xiàn)，P.aeruginosa、S.aureus、S.agalactiae在攀西地區(qū)已成為主流病原菌[12]。國內(nèi)學者對奶牛乳房炎病原菌的診斷進行了大量的研究，可以用多重PCR快速診斷引起奶牛乳房炎的病原體的種類、區(qū)系分布以及血清型[13-14]。本試驗選擇傳統(tǒng)細菌學檢測方法和本實驗室已建立的多重PCR檢測方法，分別對3個大型奶牛養(yǎng)殖場進行P.aeruginosa、S.aureus、S.agalactiae病原菌檢測，通過對比2種方法檢測病原菌的檢出率和吻合率，更好地探究乳房炎奶樣中P.aeruginosa、S.aureus、S.agalactiae的感染情況。

1 材料與方法

1.1 菌株 金黃色葡萄球菌(CMCCB26001)、無乳鏈球菌(CICC10465)和綠膿桿菌(CMCC10104)等菌種，均購自于北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術研究院。

1.2 送檢樣本 2018—2019年間，四川洪雅A場(1 000頭規(guī)模)、四川邛崍A場(600頭規(guī)模)、四川普州A場(1 000頭規(guī)模)3個奶牛場出現(xiàn)奶牛乳房炎，牛場工作人員采集奶樣(以每頭牛的患病乳區(qū)為單位)經(jīng)加州乳房炎檢測法(CMT)檢測鑒定奶樣感染類型。經(jīng)判定臨床型111份、隱性型64份、健康奶樣16份，由本實驗室采用傳統(tǒng)細菌學檢測法與多重PCR檢測法進行病原菌檢測。

1.3 試劑與儀器 DL2 000 DNA Marker、2×TaqPCR Master Mix(Blue)、滅菌雙蒸水，均購自成都擎科偉業(yè)生物技術有限公司。大豆胰蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基、腦心浸液肉湯(HBI)、卵黃甘露醇高鹽培養(yǎng)基、綿羊鮮血瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美藍培養(yǎng)基，均購自成都浩博優(yōu)有限公司。PCR儀(Thermo Fisher，SimpliAmpTM)，電泳儀(北京六一生物科技有限公司，DYY-6D)，全自動凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad，GelDoc公司)。

1.4 方法

1.4.1 傳統(tǒng)細菌學方法

1.4.1.1 樣本處理 奶樣先3 000 g離心10 min，棄去上清液，用接種環(huán)挑取沉淀物，在綿羊鮮血瓊脂培養(yǎng)基進行劃線，置37 ℃恒溫箱培育24 h，觀察菌落生長形態(tài)。再取不同形態(tài)的菌落接種在麥康凱瓊脂、KF鏈球菌瓊脂、甘露醇高鹽瓊脂選擇培養(yǎng)基，觀察細菌的生長情況，進一步進行細菌革蘭染色，顯微鏡檢查等。

1.4.1.2 生化試驗 用接種環(huán)將細菌接種指定的生化培養(yǎng)基，放置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，經(jīng)24 h培養(yǎng)后判定結果，將各項生化反應的結果與伯杰細菌手冊[15]進行對比。主要生化特性指標有麥芽糖、蔗糖、乳糖、甘露糖、葡萄糖、木糖、甘露醇、F-發(fā)酵、明膠液化、觸酶、V-P、葡萄球菌凝固酶、覃糖、環(huán)腺苷酸(CAMP)。

1.4.1.3 16S rRNA的測序 挑選每批樣品中部分菌落形態(tài)、染色鏡檢和生化結果一致的疑似菌株進行16S rRNA基因測序分析，將測序序列在NCBI上比對結果，并記錄好細菌種屬情況。

1.4.2 多重PCR檢測方法

1.4.2.1 奶樣的處理 奶樣先進行混勻處理，取2 mL樣品3 000 g離心10 min，倒掉上清液并無菌挑取管底沉淀物接種到腦心浸液肉湯，置37 ℃恒溫箱培養(yǎng)24 h。

1.4.2.2 PCR模板的制備 先將過夜培養(yǎng)的腦心浸液肉湯培養(yǎng)基12 000 g離心2 min，棄去上清液，用雙蒸水將菌體沉淀混勻制成模板。

1.4.2.3 多重PCR反應條件 反應體系和條件參考文獻[16]，將制備好的模板進行多重PCR反應。

1.4.3 吻合率計算 檢測吻合率/%=(2種檢測方法檢測的相同陽性個數(shù)+相同陰性個數(shù))/被檢測的樣本量總數(shù)×100%。用SPSS 22軟件進行數(shù)據(jù)處理，用x2檢驗對檢出率數(shù)據(jù)進行分析，以P<0.05為顯著差異，具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 傳統(tǒng)細菌學方法的分離鑒定

2.1.1 細菌的培養(yǎng)及鏡檢 甘露醇高鹽培養(yǎng)基上疑似S.aureus菌株生長呈金黃色菌落且菌落周圍會形成1個黃色的暈環(huán)，革蘭染色鏡檢為可見菌落染色呈陽性，形態(tài)是呈橢圓形，單個、成對或葡萄串狀排列。綿羊鮮血培養(yǎng)基上疑似S.agalactiae菌株生長呈β溶血的濕潤、乳白色菌落，染色鏡檢呈陽性，形態(tài)是呈成對、成鏈排列。普通瓊脂培養(yǎng)基上疑似P.aeruginosa菌株呈光滑、微隆起、邊緣整齊波狀，并且普通瓊脂培養(yǎng)基表面呈黃綠色，染色鏡檢為陰性菌，形狀是呈成對或偶爾成短鏈排列。

2.1.2 細菌的生化試驗 經(jīng)24 h培養(yǎng)后，根據(jù)伯杰細菌手冊標準株的生化特性進行細菌分類。在細菌形態(tài)、染色鏡檢歸類的基礎上，通過細菌的生化結果判定樣品中S.aureus35株、S.agalactiae48株、P.aeruginosa16株。

2.1.3 16S rRNA測序 挑選每批樣品中部分細菌形態(tài)、染色鏡檢和生化結果一致的疑似菌株進行PCR擴增，將擴增的PCR產(chǎn)物進行核酸凝膠電泳試驗，通過全功能成像儀觀察凝膠電泳結果，見圖1。

圖1 PCR擴增結果Fig.1 PCR amplification resultsM：DL2 000 DNA marker； 1:陰性對照； 2～8：陽性樣品M:DL2 000 DNA marker; 1:Negative control; 2-8:Positive samples

將跑出目的條帶的陽性樣本進行測序，并在NCBI上對得到的核苷酸序列進行比對。結果顯示，疑似S.aureus菌株與GenBank中已有S.aureus序列的相似性均高于99.79%，疑似S.agalactiae菌株與GenBank中已有S.agalactiae序列的相似性均高于99.77%，疑似P.aeruginosa菌株與GenBank中已有P.aeruginosa序列的相似性均高于99.86%。

2.1.4 傳統(tǒng)細菌學檢測方法的檢出率 在傳統(tǒng)細菌學方法鑒定中，單獨檢出9份S.aureus陽性奶樣，單獨檢出26份S.agalactiae陽性奶樣，單獨檢出2份P.aeruginosa陽性奶樣。檢出13份S.aureus+S.agalactiae陽性且P.aeruginosa陰性的奶樣，檢出5份S.aureus+P.aeruginosa陽性且S.agalactiae陰性的奶樣，檢出1份S.agalactiae+P.aeruginosa陽性且S.aureus陰性的奶樣，同時檢出3種菌陽性的有8份奶樣。

2.2 多重PCR檢測方法

2.2.1 多重PCR檢測方法的檢出率 多重PCR檢測法中，用多重PCR的條件與體系進行PCR擴增(圖2、圖3)。結果顯示，單獨檢出10份S.aureus陽性奶樣，單獨檢出30份S.agalactiae陽性奶樣，單獨檢出6份P.aeruginosa陽性奶樣。檢出16份S.aureus+S.agalactiae陽性且P.aeruginosa陰性的奶樣，檢出10份S.aureus+P.aeruginosa陽性且S.agalactiae陰性的奶樣，檢出5份S.agalactiae+P.aeruginosa陽性且S.aureus陰性的奶樣，同時檢出3種細菌陽性的有9份奶樣。

圖2 部分樣品PCR擴增結果Fig.2 PCR amplification results of some samplesM:DL2 000 marker； 1～12、14、15:隱性乳房炎樣品； 13:正常奶樣； 16：陰性對照M:DL2 000 marker; 1-12,14,15:Subclinical mastitis sample; 13:Normal milk sample; 16:Negative control

圖3 部分樣品PCR擴增結果Fig.3 PCR amplification results of some samplesM:DL2 000 marker; 1～6：臨床型乳房炎樣品； 7：陰性對照M:DL2 000 marker; 1-6:Clinical mastitis milk sample; 7:Negative control

2.3 2種方法的細菌檢出率與吻合率 通過傳統(tǒng)細菌學檢測法與多重PCR檢測法2種方法對111份臨床乳房炎奶樣、64份隱性乳房炎奶樣、16份正常奶樣中S.aureus、S.agalactiae和P.aeruginosa進行檢測，并用卡方檢驗對不同感染類型進行分析，檢出份數(shù)結果見表1。通過吻合率公式進行2種檢測方法吻合率比較，在111份臨床型乳房炎奶樣中，2種方法關于S.aureus、S.agalactiae和P.aeruginosa的檢出吻合率分別為92.8%、96.4%和90.1%。在64份隱性乳房炎奶樣中，2種方法關于S.aureus、S.agalactiae和P.aeruginosa的檢出吻合率分別為96.9%、89.1%和96.9%。在16份正常奶樣中，2種方法關于S.aureus、S.agalactiae和P.aeruginosa的檢出吻合率分別為100%、93.8%和93.8%。2種方法關于S.aureus、S.agalactiae和P.aeruginosa的總體檢出吻合率分別為94.8%、93.7%和92.7%。在S.aureus、S.agalactiae和P.aeruginosa的單一感染和復合感染的檢測中，無論是臨床型乳房炎奶樣還是隱性乳房炎奶樣其檢出吻合率均在92%以上。

表1 乳樣中細菌檢出的結果Table 1 Results of total bacterial detection in milk samples

運用2種方法檢測111份臨床乳房炎樣品中的病原菌，多重PCR檢測法檢出74株致病菌，檢出率為66.7%，傳統(tǒng)細菌學培養(yǎng)法檢出51株致病菌，檢出率為45.9%，通過卡方檢驗得出多重PCR檢測方法與傳統(tǒng)細菌學檢測方法差異顯著(P<0.05)，具有統(tǒng)計學意義。結果表明多重PCR檢測法可以在臨床乳房炎奶樣中進行致病菌的檢測，臨床應用效果比較好，并且多重PCR檢測法在綠膿桿菌檢測中敏感性比較高(表2)。

表2 2種方法對臨床乳房炎中致病菌的檢出率比較Table 2 Comparison of detection rates of pathogenic bacteria in clinical mastitis by two methods

運用2種方法檢測了64份隱性乳房炎樣品中的病原菌，多重PCR檢測法檢測出56株致病菌，檢出率為87.5%，傳統(tǒng)細菌學培養(yǎng)法檢測出45株致病菌，檢出率為70.3%。通過卡方檢驗得出多重PCR檢測方法與傳統(tǒng)細菌學檢測方法差異顯著(P<0.05)，具有統(tǒng)計學意義。結果表明多重PCR檢測法可以運用于隱性乳房炎奶樣致病菌的檢測，臨床應用效果比較好(表3)。同時，在16份正常奶樣中，通過卡方檢驗得出多重PCR檢測方法與傳統(tǒng)細菌學檢測方法差異不顯著，可能與正常乳樣的污染程度小，細菌檢出率低等相關。

表3 2種方法對隱性乳房炎中致病菌的檢出率比較Table 3 Comparison of detection rates of pathogenic bacteria in subclinical mastitis by two methods

2.4 總樣品檢出率的比較 用2種方法對191份牛奶樣本進行檢查，對不同的感染類型進行卡方檢驗分析，具體結果見表4。191份臨床樣品中,多重PCR檢測方法檢測出135株致病菌,檢出率為70.7%,傳統(tǒng)細菌學培養(yǎng)法檢測出99株致病菌,檢出率為51.8%,通過卡方檢驗得出多重PCR檢測方法與傳統(tǒng)細菌學檢測方法差異極顯著(P<0.05)，具有統(tǒng)計學意義。結果表明多重PCR檢測法可以應用于奶樣中混合致病菌的檢測，臨床應用效果比較好。

表4 2種方法對不同類型致病菌的檢出率比較Table 4 Comparison of detection rates of different types of pathogenic bacteria by two methods

3 討論

3.1S.aureus、S.agalactiae和P.aeruginosa的檢出率情況 據(jù)報道S.aureus、S.agalactiae、P.aeruginosa等病原菌感染是引起奶牛乳房炎的主要病原菌[17-19]。2005年，劉文進等[20]對新疆墾區(qū)的7個奶牛場進行調(diào)查發(fā)現(xiàn)，S.aureus已經(jīng)取代鏈球菌成為最主要致病菌，并且P.aeruginosa的檢出率明顯增加。在本試驗中，通過對患有乳房炎臨床樣品檢測，結果與羅金印等[21]報道結果基本一致，但與國內(nèi)其他地區(qū)報道結果不一致[22-25]，這說明細菌感染率與地理位置和養(yǎng)殖環(huán)境相關。同時，丁天翊等[26]報道，奶牛乳房炎中S.agalactiae的檢出率比較高，并且混合菌株感染比單一菌株感染率高。聶培[27]研究發(fā)現(xiàn)，奶牛乳房炎病原菌分離中S.aureus檢出率為14.7%，混合感染率達77.4%。本試驗采用2種不同的檢測方法，發(fā)現(xiàn)3個奶牛場的S.agalactiae感染比較嚴重，重點加強無乳鏈球菌的預防和治療，混合感染率高于單菌株感染率。結果顯示，3個奶牛場的隱性乳房炎感染情況比較嚴重，加強隱性乳房炎的預防和治療。

3.2 傳統(tǒng)細菌學培養(yǎng)法與多重PCR檢測方法的比較 目前已有研究者建立了S.aureus、S.agalactiae、P.aeruginosa等細菌的多重PCR檢測方法，多重PCR檢測相較于傳統(tǒng)細菌學培養(yǎng)法具有靈敏度高、可信度強等優(yōu)勢[28-29]。前期建立的用于奶牛乳房炎的多重PCR檢測方法，沒有涉及P.aeruginosa細菌。目前，P.aeruginosa引起奶牛乳房炎的發(fā)生及檢出率增加，應開展針對P.aeruginosa及乳房炎相關病原菌如S.aureus、S.agalactiae等的檢測方法研究，本試驗建立的多重PCR檢測方法可同時檢出S.aureus、S.agalactiae、P.aeruginosa。本試驗通過檢測111份臨床型乳房炎奶樣并統(tǒng)計檢出S.aureus、S.agalactiae和P.aeruginosa陽性數(shù)據(jù)可知，傳統(tǒng)細菌學檢測方法分別為19份、20份、12份；多重PCR方法分別為27份、24份、23份，可推測多重PCR檢測法在臨床型乳房炎奶樣檢出能力強于傳統(tǒng)細菌學培養(yǎng)法。結合2種方法在64份隱性乳房炎樣品及16份正常奶樣中S.aureus、S.agalactiae和P.aeruginosa陽性奶樣的檢出率與吻合率，結果顯示多重PCR檢測法的檢測效果與傳統(tǒng)細菌學檢測方法效果吻合度均在92%以上。同時，通過卡方檢驗對臨床乳房炎樣品、隱性乳房炎樣品及正常奶樣品的2種方法檢測結果進行檢驗，得出臨床乳房炎樣品及隱性乳房炎樣品中多重PCR檢測方法與傳統(tǒng)細菌學檢測方法差異顯著(P<0.05)。本試驗建立的多重PCR檢測方法可用于生產(chǎn)實踐中，在臨床乳房炎樣品中檢測S.aureus、S.agalactiae和P.aeruginosa三種細菌的結果準確可信，有利于降低檢測成本和節(jié)省確定病原菌時間[30-31]。