HPLC法測定藏藥三果湯中沒食子酸、三沒食子酰基葡萄糖和五沒食子酰基葡萄糖的含量

黃 寬 林艾和 張艷嬌 范 源,2*

1.云南中醫藥大學，云南 昆明 650500；2.云南中醫藥大學第二附屬醫院，云南 昆明 650216

藏藥三果湯又名哲布湯，由余甘子、訶子、毛訶子組成，是藏藥中重要的常見基礎方，具有調節“隆”和“血”的功效。三果湯始載于《四部醫典》，具有治療瘟疫、紊亂熱癥、促使熱癥成型的作用[1]。傳統中醫學認為三果湯方中余甘子味甘、酸、澀，歸肺、胃經，性涼；訶子味苦、酸、澀，歸肺、大腸經，性平；毛訶子味甘、澀，性平。三味藥合用具有清熱、調和氣血的功效。

現代藥理學研究表明，三果湯具有抗菌[2]、抗炎[3-4]、抗腫瘤[5-6]、抗氧化[7-8]、降糖[9]、降脂[10]等藥理作用。三果湯主要含有鞣質酚酸類成分[11]，沒食子酸是鞣質的重要組成成分，其常見的衍生物為1，3，6-O-三沒食子酰基葡萄糖和1，2，3，4，6-五-O-沒食子酰基葡萄糖，研究發現沒食子酸及其酯類衍生物都具有抗癌藥理活性[12-13]。目前研究單味藥的化學成分含量及藥理活性較為常見，而對三果湯復方研究較少。本研究針對三果湯中沒食子酸及其衍生物1，3，6-O-三沒食子酰基葡萄糖、1，2，3，4，6-五-O-沒食子酰基葡萄糖進行含量測定，為提高藏藥三果湯質量控制提供理論基礎。

1 儀器與試劑

Agilent 1200高效液相色譜儀(美國Agilent公司)，色譜柱為 Agilent Zorbax C18鍵合硅膠柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；DFY-600搖擺式高速萬能粉碎機(永康式速鋒工貿有限公司)；T-1000型電子天平(上海浦春計量儀器有限公司)；AB265-SMETTLER TOLEDO十萬分之一分析天平(梅特勒-托利多國際貿易(上海)有限公司)。

沒食子酸(Gallica acid，GA)購自四川省維克奇生物科技有限公司(批號：wkq16081904)、1，3，6-O-三沒食子酰基葡萄糖(1,3,6-tri-O-galloyl-β-D-glucose，TGG)購自武漢天植生物技術有限公司(批號：CFS201802)、1，2，3，4，6-五-O-沒食子酰基葡萄糖(1,2,3,4,6-O-galloyl-D-glucose，PGG)購自成都普瑞法科技開發有限公司(批號：PRF10011001)；乙腈(色譜純)，磷酸(分析純)購自天津市風船化學試劑有限公司；Agilent 1200高效液相色譜儀，色譜柱為 Agilent Zorbax C18鍵合硅膠柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；電子天平(購自北京賽多利斯儀器系統有限公司)。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜條件：色譜柱為Agilent C18柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流動相：乙腈-0.1%磷酸水溶液；梯度洗脫：0～6 min，4%～8%；6～30 min，8%～20%；30～55 min，20%～40%；檢測波長260 nm；柱溫：25 ℃；流速：0.8 mL/min；進樣量為10 μL。色譜圖如圖1所示。

圖1 高效液相色譜圖

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 分別精密稱取GA、3GG、PGG對照品3.9 mg、1.3 mg、0.7 mg，置于10 mL量瓶中，用甲醇配制成含GA、3GG、PGG 0.39 mg/mL、0.13 mg/mL、0.07 mg/mL的混合對照品溶液，用0.45 μm的微孔濾膜進行過濾處理，備用。

2.2.2 供試品溶液 取訶子、毛訶子、余甘子藥材(去核)各5.0 g，搗碎，加入100 mL餾水，浸泡30 min，煎煮3次，每次20 min，過濾，合并3次濾液，濃縮10 mL的三果湯水提物，吸取水提物1 mL，加50%甲醇定容50 mL容量瓶中，冷藏備用。用0.45 μm的微孔濾膜進行過濾處理，即得到樣品溶液。

2.3 線性關系考察 配制不同質量濃度的對照品溶液，在“2.1”項條件下依次連續進樣，以質量濃度(mg/mL)為橫坐標(X)，峰面積(mAU*s)為縱坐標(Y)進行線性回歸，繪制標準曲線，結果見表1，表明各成分均具有良好的線性關系。

表1 線性關系考察結果

2.4 精密度 試驗精密吸取“2.2.1”項下混合對照品溶液，在“2.1”項條件下連續進樣6次，結果顯示GA、TGG、PGG峰面積RSD分別為1.22%、1.58%、1.01%，表明儀器精密度良好。

2.5 穩定性試驗 取同一份供試品溶液，在“2.1”項條件下，分別于2、4、6、8、10、12 h進樣，結果顯示GA、TGG、PGG 10 h內峰面積的RSD值分別為0.77%、1.39%、1.08%，表明供試品溶液在12 h內穩定性良好。

2.6 重復性試驗 取同一批三果湯粉末6份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項條件下進樣，結果顯示GA、TGG、PGG含有量RSD分別為1.18%、0.37%、0.83%，表明該方法重復性良好。

2.7 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的同一批三果湯粉末6份，每份精密稱取5.0 g，按“2.2.2”項下方法制備供試溶液，加入GA、TGG、PGG對照品適量(約相當于5.0 g樣品中所含GA、3GG和PGG的量)，再按“2.3”項下色譜條件，進樣10 μL，進行檢測，計算平均回收率。按“2.2.3”項下方法制備供試溶液，在“2.1”項條件下進樣。結果見表2。

2.8 含量測定 取3份不同批次余甘子樣品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項下條件下進樣，計算四種成分含有量。結果見表3。

表2 加樣回收率試驗 (n=9)

表3 含量測定結果

3 討論

三果湯作為傳統藏藥在臨床上應用廣泛，且具有良好的臨床療效。鞣質酚酸類化合物是三果湯的主要有效成分，易溶于水，故本研究采用水提的方式處理樣品。對比煎煮次數，結果顯示，煎煮三次時，含量達到最高。

預實驗分別以甲醇-水溶液、乙腈-水溶液、甲醇-磷酸水溶液、乙腈-磷酸水溶液作為流動相進行考察，當乙腈-0.1%磷酸水溶液為流動相時，采用梯度洗脫，目標峰的色譜圖峰拖尾得到改善，且峰形更好，達到更高的分離度，因此選定乙腈-0.1%磷酸水溶液作為流動相。另外，還對柱溫(25、30、35、40 ℃)和流速(0.5、0.8、1.0、1.2、1.5 mL/min)進行了優化，結果顯示，柱溫25 ℃、流速0.8 mL/min 時分離效果較佳。

本研究建立同時測定藏藥三果湯中沒食子酸、1，3，6-O-三沒食子酰基葡萄糖、1，2，3，4，6-五-O-沒食子酰基葡萄糖含量的高效液相色譜法，供試品制備簡便，結果準確，重復性好，專屬性高，結果可靠，可為三果湯質量控制提供一定依據。