不同性型水果黃瓜內過氧化物酶及同工酶的差異性分析

王鶴冰 向華豐 張洪成 張生

摘 要 為給水果黃瓜材料創制中性型的快速鑒定提供簡易方法，以2對不同性型的水果黃瓜姊妹系為試驗材料，比較分析其過氧化物酶活性和過氧化物同工酶電泳譜帶的差異，結果表明雌性系材料中過氧化物酶活性明顯較普通株系高，且同工酶電泳圖中有明顯的3條譜帶。

關鍵詞 水果黃瓜;性型;過氧化物酶;過氧化物同工酶;差異性

水果黃瓜又稱迷你黃瓜、小黃瓜，是從歐洲引進的主要適宜溫室栽培的鮮食類黃瓜品種，在很多地區作為名特優蔬菜被廣泛引種栽培[1]。水果黃瓜作為黃瓜的一個分支，主要分布在英國、荷蘭等地[2]。由于引種較晚，中國目前此類資源缺乏，生產用種多為外國品種。為提升國內的自主育種能力，近年來側重在資源的搜集與創制上下文章。目前，我國引種的水果黃瓜品種多為雌性系，不能自交繁殖[3]，且制種過程較繁瑣。為了培育出優良的水果黃瓜品種，創制出不同性型的水果黃瓜材料十分必要。

通過多年的材料引進與純化篩選，我國不同類型的水果黃瓜材料逐漸增加，不同性型的育種材料也逐漸出現，但急需找到一個簡單便捷的性型鑒定方法。

黃瓜材料性型的判斷方法很多，最直觀的方法是在生育期進行田間自然鑒定，但耗費時間長，受環境影響大。隨著分子生物學研究的發展，分子標記技術逐漸應用于作物輔助育種，找到與所需性狀密切相關的特異性分子標記，是在不同環境影響下，對作物復雜性狀進行判斷的有效途徑。近年來分子標記在黃瓜雌性系選育中逐步應用，如厲建梅等用SSR 分子標記進行黃瓜雌性性狀的多態性篩選，得到標記位點21個[4];苗晗等將F9代RILs群體用于復雌花QTL的定位分析，從中找到8個控制復雌花性狀的QTL位點[5]。分子標記技術的發展也為后來雌性基因的定位奠定了基礎。但無論哪個方法，對于常規的育種者來講，都存在一定的局限性，因而研究還在進一步深入。

1995年，馬蓉麗在進行黃瓜雌性系選育時，對黃瓜雌性系和其他品種粗淺地進行了種子萌動時期的過氧化物同工酶分析，發現雌性系與其他品種比較存在差異[6]，但未做進一步研究。之后此方面的研究也并未引起重視，但如果酶的差異可區分黃瓜材料的性型，將是一個快速的檢測方法。

本試驗以此為切入點，以不同性型的水果黃瓜姊妹系為試驗材料進行研究，尋找不同性型水果黃瓜中過氧化物酶及同工酶的差異，以其為材料選擇中性型的判斷提供一個快速的評判方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以黃瓜課題組自己篩選純化出的2對水果黃瓜姊妹系（A1-A2，B1-B2）為試驗材料。性型類別見表1。

試驗材料于春季在田間自然條件下播種、育苗，在植株3葉1心期進行取樣，取葉片部分用于試驗。

1.2 試驗方法

1.2.1 材料性型的田間鑒定

為確定材料的性型穩定性與一致性，在田間自然條件下進行性型鑒定[7]。試驗在春秋兩季不同溫度環境下進行，以消除溫度對黃瓜性型分化的影響。

材料采取常規穴盤育苗方式，3葉1心時定植于露地，每份材料隨機選取10株，調查其20節內的雌花節位。

1.2.2 過氧化物酶測定

過氧化物酶（POD）活性測定采用愈創木酚法[8]進行。

樣品制備的步驟：稱取0.2 g葉片組織，加入1 mL提取液，在冰浴上研磨成勻漿。于12 000 r?min-1、4 ℃條件下離心10 min，取上清液，置于冰面上待用。

1.2.3 過氧化物同工酶電泳分析

過氧化物同工酶電泳采用垂直板SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）技術[8]進行。

每個試驗材料隨機取樣兩份作為重復，進行同工酶電泳試驗。

樣品制備步驟：稱取試驗材料葉片0.5 g加入液氮研磨成粉末狀，加入1.5 mL Tris-Hcl繼續研磨成勻漿，倒入5 mL離心管中，再分次用2 mL Tris-Hcl將研缽沖洗干凈轉入離心管中。在11 000 r?min-1、4 ℃條件下離心20 min，取上清液（酶提取液），將其分裝在2 mL離心管中與溴酚藍（1.5 mL酶提取液+20 μL溴酚藍）混合均勻后，置于-80 ℃冰箱儲存備用。

2 結果與分析

2.1 雌性系材料的確定

因黃瓜的性型分化受溫度影響較大，因而在試驗進行前，再次對所選取的各水果黃瓜試驗材料性型進行鑒定，確保后續試驗材料性型具有代表性。

從表2的各材料平均雌花節位數統計可見，雌性系材料的雌花節位穩定，而普通株系在春秋兩季的雌花節位數變化較大，在B2材料中秋季雌花節位數降低了16%。對各材料的雌花節率（見表3）進行計算，可見兩對材料現狀穩定，均為一個雌性系，一個普通株，其中A1為全雌株，雌花率100%，即無論在任何環境下均無雄花出現。

2.2 過氧化物酶活性分析

測定各材料的過氧化物酶，對2對材料的過氧化物酶活性進行比較分析，結果見圖1。兩對材料中，雌性系材料的過氧化物酶活性均明顯高于普通株系，B1的酶活比B2高44%，而A1（全雌株類型的雌性系）的酶活更高，較對應的A2普通株系高56%。可見水果黃瓜中雌性比例越高，其過氧化物酶活性越強。但2對材料中雌性系與普通株間的過氧化物酶活性的臨界值還有待進一步探索。

2.3 過氧化物同工酶譜帶分析

從各材料的同工酶電泳圖（見圖2 ）中可清楚的看見，在每個姊妹系中，雌性系材料的同工酶譜帶最后一條與普通株系均有明顯差異。

雌性株系的同工酶譜有明顯的3條條帶，而普通株系只有2條明顯的條帶;在普通株系電泳圖中，A2材料的第3條譜帶顏色很淡，B2材料的第3條譜帶甚至完全消失不見。

3 小結

性型在黃瓜育種中有著重要的地位，特別是當黃瓜育種工作由常規育種逐漸轉向雜交育種后，雌性系更是因其簡便易行的制種技術被育種者們在研究和利用中廣泛青睞[9]。因而找到一個簡易的材料鑒別方式對材料的選擇十分必要。水果黃瓜材料中多數為雌性系，因而以其為試材，具有代表性。

抗氧化系統是植物抵抗逆境脅迫的重要防御系統，超氧化物歧化酶（SOD）、（過氧化氫酶）CAT和過氧化物酶（POD）是植物清除活性氧的重要抗氧化防御酶[10]。黃瓜的性型分化與溫度關系密切，如溫度在正常水平上升高，其雌花分化率明顯降低，這可能與抗高溫逆境脅迫有關，因此該試驗就黃瓜雌性與POD間的相關性展開研究。

試驗通過對水果黃瓜雌性系與其姊妹系的普通株系間的過氧化物酶活性及同工酶電泳譜帶的比較分析，得到了水果黃瓜普通系與雌性系間過氧化物酶的明顯差異，雌性系材料的過氧化物酶活性明顯升高，且同工酶譜帶有明顯的3條;而普通株系中，過氧化物酶活性相對較低，且同工酶譜帶只用2條清晰譜帶，第3條譜帶顏色很淺，甚至消失。

參考文獻：

[1]? 張顯真，楊曉峰.溫室水果黃瓜葉片生長規律研究[J].氣象與減災研究，2008，31（04）：43-47.

[2]? 中國農業科學院蔬菜花卉研究所.中國蔬菜栽培學[M].北京：中國農業出版社，2009：624.

[3]? 楊國志，袁偉，葉立華，等.水果黃瓜化學誘雄技術[J].浙江農業科學，2017，58（02）：209-210，213.

[4]? 厲建梅，辛明，秦智偉，等.黃瓜雌性性狀的QTL定位分析[J].東北農業大學學報，2012，43（10）：125-129.

[5]? 苗晗，顧興芳，張圣平，等.黃瓜復雌花性狀QTL定位分析[J].園藝學報，2010，37（09）：1449-1455.

[6]? 馬蓉麗.黃瓜雌性系選育的研究[J].山西農業科學，1995，23（04）：35-38.

[7]? 王鶴冰，向華豐，張洪成.黃瓜雌型材料篩選與留種技術研究[J].植物醫生，2018（08）：22-23.

[8]? 張志良，瞿偉菁，李小芳.植物生理學實驗指導（3版）[M].北京：高等教育出版社.2009.

[9]? 王鶴冰，向華豐，張生，等.中國黃瓜雌性系研究進展[J].中國農學通報，2015，31（10）：92-96.

[10] 王斌，朱世江.階段降溫對冷藏黃瓜耐冷性的誘導作用[J].江蘇農業學報，2020，36（04）：1028-1035.

（責任編輯：敬廷桃）