外周血中miRNAs表達水平對精神分裂癥的診斷價值

管娟，劉珺，秦文

(武漢市精神衛生中心十五病區精神科，湖北 武漢 430014)

精神分裂癥是一種常見的精神類疾病，其終生患病風險接近1%[1]。目前，精神分裂癥的診斷主要基于評估患者的臨床癥狀和行為，但其病理生理學和生化指標的實驗室檢測還未得到有效利用。miRNAs是一類內源性短鏈非編碼RNA，參與編碼蛋白基因的轉錄后調控[2-3]。miRNAs不僅可以調節眾多重要的生物學功能，還參與了幾乎所有的生命過程[4-5]。并且miRNAs的表達水平可以反映了精神分裂癥等精神疾病在遺傳和生物學方面的改變[6-8]。盡管精神分裂癥的病因尚未明確，但在精神分裂癥患者的腦組織、外周血、血清、血漿中均可檢測到miRNAs的異常表達[9-10]。而Sullivan等[11]指出，miRNAs在全血和腦組織中的表達相似。Harris等[12]也發現，血液中生物標志物的變化可反映大腦的病理過程。由于患者腦組織不易獲得，對精神分裂癥的病理生理學和潛在的生物標志物的研究越來越依賴于血液中miRNA表達[13]。因此，本研究根據文獻報道及相關數據庫初步篩選出14個候選miRNAs，通過實時熒光定量聚合酶鏈式反應(real time-quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)進一步驗證其在精神分裂癥中表達情況，并采用受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic curve，ROC)分析其對精神分裂癥的診斷價值。為了闡明存在差異表達的miRNAs的功能及相關的調控網絡，采用生物信息學進一步分析其相關的作用途徑和調控的靶基因，為進一步深入研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

數表法隨機選取2018年10月至2019年10月武漢市精神衛生中心收治的40例精神分裂癥患者作為觀察組。其中，男性26例，女性14例；年齡18～60歲，平均(43.25±6.13)歲；病程(3.21±2.04)年；疾病分類中偏執型25例、殘留型4例、未分化型7例、其他4例。所有患者均符合美國精神障礙診斷與統計手冊(第4版)修訂版的相關診斷標準，所有受試者均由至少兩位經驗豐富的精神病學家診斷為精神分裂癥患者。研究獲得武漢市精神衛生中心醫學倫理委員會審核批準。納入標準：(1)年齡≥18周歲；(2)符合精神分裂癥相關診斷標準；(3)未治療期不超過兩年；(4)臨床資料完整者；(5)治療前，患者或家屬同意抽取血樣，進行后續研究者。排除標準：(1)合并嚴重心、腦、肝等系統性疾病者；(2)長期服用抗精神病藥物者；(3)合并嚴重軀體疾病者；(4)合并感染、免疫類疾病者。另選武漢市精神衛生中心同期40名健康體檢者作為對照組。兩組性別、年齡、體質指數及受教育年限等一般資料比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

1.2 方法

1.2.1 外周血的采集 80名受試者于治療前清晨空腹采集外周血5 mL，并收集于乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)抗凝管中。立于冰上30 min后，吸出上清。10 000 g離心5 min，棄沉淀。取上清保存于-80 ℃，待提取總RNA。

1.2.2 miRNA的篩選 根據文獻報道和相關數據庫初步篩選出14個候選miRNAs，分別為miR-30d-5p、miR-181b-3p、miR-652-5p、miR-193a-3p、miR-181b-5p、miR-34a-5p、miR-346、miR-572、miR-7-5p、miR-449a、miR-564、miR-22-3p、miR-548d-3p和miR-30a-5p。

表1 兩組一般資料比較

1.2.3 RNA提取和miRNA定量RT-qPCR 使用miRcute血清/血漿miRNA提取分離試劑盒(DP503，天根生化科技有限公司，北京)提取總RNA。采用Nanodrop光譜儀(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA)檢測RNA純度和濃度。隨后，使用逆轉錄系統將RNA反向轉錄為cDNA(Thermo Scientific，CA，USA)。采用RT-qPCR 2 x SYBR qPCR Mix(北京中曼生物技術有限公司，中國)檢測miRNA的水平。擴增體系如下：PCR反應包含2 μL cDNA、0.4 μL正向引物、0.4 μL反向引物、7.2 μL H2O2和10 μL SYBR Green核酸染料；擴增條件為25 ℃ 10 min、48 ℃ 30 min、95 ℃ 5 min，U6作為實驗內參。每個樣本檢測3次，采用2-ΔΔCt法分析miRNA的表達水平[14]，首先計算出每個樣品內參基因的表達量ΔCt，再計算對照組中ΔCt的均值，用觀察組每個樣品的ΔCt減去對照組的ΔCt均值，得到ΔΔCt，采用2-ΔΔCt公式計算出觀察組的表達量。miRNAs和U6引物信息見表2。

1.3 統計學分析

1.4 生物信息學分析

為了進一步研究miRNAs的功能作用，對具有差異表達的miRNAs進行生物信息學分析，以確定可能的miRNA靶基因。采用Target Scan和miRanda預測miRNA的靶基因。利用京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG，https://www.genome.jp/kegg/)和注釋、可視化和集成發現數據庫(Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery，DAVID，https://david.ncifcrf.gov/)對基因進行通路和功能富集分析。通過上述軟件自帶的分析工具，采用Fisher精確檢驗來識別KEGG中富集基因的靶向通路。

表2 miRNAs和U6引物信息

根據生物信息學分析，SATB2，PER2和SAMD12是差異表達的miRNAs的關鍵靶基因。采用RT-qPCR方法檢測三個基因的表達情況。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)為內參，每個樣本檢測3次，采用2-ΔΔCt法分析其表達情況[14]。

2 結果

2.1 兩組受試者外周血miRNAs表達水平比較

兩組受試者外周血miR-30d-5p、miR-181b-3p、miR-652-5p、miR-193a-3p、miR-181b-5p、miR-346、miR-572、miR-7-5p、、miR-564、、miR-548d-3p和miR-30a-5p表達水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)，且觀察組miR-34a-5p、miR-449a和miR-22-3p表達水平高于對照組(P<0.05)。見表3。

表3 兩組受試者外周血miRNAs表達水平比較

2.2 miR-34a-5p、miR-449a和miR-22-3p對精神分裂癥的診斷價值

通過ROC曲線分析miR-34a-5p、miR-449a和miR-22-3p對精神分裂癥的診斷價值，miR-34a-5p、miR-449a和miR-22-3p 的AUC值分別為0.763，0.659和0.725，均大于0.6，三者聯合檢測的AUC值為0.802。見圖1。

2.3 miR-34a-5p、miR-449a和miR-22-3p靶基因功能注釋及通路分析

miR-34a-5p靶基因主要存在于細胞核質，參與突觸導向、神經嵴細胞遷移、多巴胺能神經突觸相關信號通路等。miR-449a靶基因主要存在于神經元胞體，參與化學突觸傳遞、神經系統發育、突觸小泡循環通路等。miR-22-3p靶基因主要存在于細胞核內，參與突觸增強、神經元遷移、神經營養蛋白信號通路等。見表4。

表4 miR-34a-5p、miR-449a和miR-22-3p靶基因功能注釋及通路分析

2.4 miR-34a-5p、miR-449a和miR-22-3p共同靶向基因的表達情況

通過生物信息學分析，miR-34a-5p、miR-449a和miR-22-3p共同靶基因為SATB2，PER2和SAMD12(圖2A)。采用RT-qPCR分析兩組SATB2，PER2和SAMD12表達水平發現，觀察組SATB2(0.46±0.06)和PER2(0.39±0.05)水平與對照組比較明顯降低(1.13±0.12；1.03±0.11)(P<0.05)，SAMD12表達水平兩組無明顯差異(P>0.05)。見圖2B-2D。

3 討論

精神分裂癥是一種異質性精神病，具有廣泛的臨床和生物學表現。但由于缺乏客觀的測試，對于精神分裂癥的準確診斷和有效治療的臨床選擇仍然具有一定的挑戰性[15]。本研究證實miR-34a-5p、miR-449a和miR-22-3p在精神分裂癥患者外周血中表現出顯著變化，提示它們可能在精神分裂癥的發生及發展中發揮著重要作用。既往研究[16-20]表明，miR-34a在神經發生和神經分化方面具有顯著的作用，并且精神障礙患者腦組織中的miR-34a表達異常。另外，眾多研究[21-23]也證實miR-449和miR-34b/c在大腦發育中起著重要作用。但是，miR-22-3p在精神分裂癥中的作用研究較少，miR-34a-5p、miR-449a和miR-22-3p對精神分裂癥的綜合影響也尚未完全清楚。

Target Scan和miRanda是被廣泛用于預測miRNAs靶向基因的在線軟件。根據Target Scan和miRanda的預測，本研究對miR-34a-5p、miR-449a和miR-22-3p的靶基因進行通路和基因功能分析，結果表明，miR-34a-5p靶基因主要存在于細胞核質，參與突觸導向、神經嵴細胞遷移、多巴胺能神經突觸相關信號通路等。miR-449a靶基因主要存在于神經元胞體，參與化學突觸傳遞、神經系統發育、突觸小泡循環通路等。miR-22-3p靶基因主要存在于細胞核內，參與突觸增強、神經元遷移、神經營養蛋白信號通路等。而精神分裂癥是一種起源于神經發育的復雜疾病，其特征是皮層和皮層下突觸可塑性異常，神經遞質(包括多巴胺、谷氨酸和血清素)的異常表達，以及信號轉導功能障礙等[24-25]。miRNA已成為基因表達調控中必不可少的轉錄后調控因子，在大腦發育和神經可塑性中的重要性已得到公認。另外本研究通過生物信息學分析，miR-34a-5p、miR-449a和miR-22-3p共同靶基因為SATB2，PER2和SAMD12。通過RT-qPCR進一步分析發現，精神分裂癥患者SATB2和PER2水平與健康對照組比較明顯降低，miR-34a-5p、miR-449a和miR-22-3p可能通過直接作用于SATB2和PER2基因參與精神分裂癥的發生發展。

綜上所述，miR-34a-5p、miR-449a和miR-22-3p在精神分裂癥中異常表達。通過ROC曲線分析提示這3種miRNAs結合可作為精神分裂癥診斷的生物標志物。基因通路和功能分析顯示，miR-34a-5p、miR-449a和miR-22-3p靶基因與突觸結構和神經功能密切相關，在精神分裂癥的病因學和病理生理學中發揮重要作用，也可能作為精神分裂癥診斷規范和治療監測的生物標記。