患者卵巢組織中激活素A及其受體的表達水平與臨床意義

田麗檳，明小瓊，陳莉莉

(華潤武鋼總醫院婦產科，湖北 武漢 430080)

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)是女性最常見的內分泌疾病之一，發病率約為3%～10%，其最常見的特征為性激素失衡，常見癥狀包括月經周期不調、多囊卵巢和多毛癥，該疾病還可能引起不孕、胰島素抵抗、糖耐量受損和血脂異常等。雖然目前PCOS的病因尚未完全清楚，但研究[1]表明激活素能夠刺激垂體釋放卵泡刺激素(follicle stimulating hormone，FSH)，參與卵巢功能的維持。激活素中已經描述了5種類型的β亞基，其中激活素A(activin A，ACTA)、激活素B和激活素AB具有明確的生物活性[2]。Bloise等[3]在對哺乳動物ACTA的生理學功能進行綜述中指出，ACTA在PCOS中具有調控作用，其中包括對垂體、卵巢內分泌的調節，對月經周期中卵泡生長發育的調節，且在妊娠的發生、維持中均有不可缺少的作用。然而，目前國內外針對ACTA對正常卵巢組織自分泌/旁分泌的研究大部分仍為動物試驗，對人類卵巢組織的研究極少，且關于PCOS患者激活素表達水平及其與妊娠結局的關系的研究則尚未見報道。為此，本研究對PCOS與卵巢功能正常者ACTA及其受體表達水平進行比較，并進一步分析卵巢楔形切除術后不同妊娠結局PCOS患者間差異，旨在為PCOS患者治療方案的選擇及其妊娠結局預測提供科學依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年6月至2018年6月于華潤武鋼總醫院行腹腔鏡卵巢楔形切除術的30例PCOS患者為研究對象，患者術后均給予常規促排卵治療，對其進行為期2年的隨訪。根據是否妊娠分為妊娠組和未妊娠組，每組各15例。另選取同期于本院行手術治療的15例月經周期及排卵正常，且卵泡早期測定各激素水平正常的子宮肌瘤、子宮內膜異位癥患者為對照組。妊娠組患者平均年齡(28.66±6.34)歲，BMI指數(22.51±2.23)kg/m2，病程(2.98±1.44)年；未妊娠組患者平均年齡(28.23±6.50)歲，BMI指數(22.33±2.62)kg/m2，病程(2.84±1.32)年；對照組患者平均年齡(28.58±5.99)歲，BMI指數(22.60±2.04)kg/m2，病程(2.86±1.27)年。本研究經醫院倫理委員會批準，患者自愿參加試驗并簽署知情同意書，且三組年齡、BMI指數、病程等基線資料比較，差異無統計學意義(P>0.05)。

入組標準：(1)PCOS妊娠組、未妊娠組符合2018年中華醫學會婦產科學分會內分泌學組及指南專家組制定的《多囊卵巢綜合征中國診療指南》診斷標準[4]，行腹腔鏡卵巢楔形切除術治療；(2)對照組符合子宮肌瘤、子宮內膜異位癥診斷標準，行腹腔鏡手術治療；(3)年齡20～35歲；(4)近3個月未服用激素類藥物；(5)臨床資料完整。排除標準：(1)糖尿病、高血壓患者；(2)心腦血管疾病、造血系統疾病、惡性腫瘤患者；(3)嚴重精神類疾病患者。

1.2 方法

1.2.1 血清激素水平測定 于清晨空腹狀態下取患者靜脈血3 mL，分離血清后，采用電化學發光發測定三組患者血清促卵泡生成素(FSH)、促黃體生成素(LH)水平，計算LH/FSH值，檢測試劑購自羅氏公司。

1.2.2 卵巢組織ACTA、ACTR IIA、ACTR IIB蛋白表達檢測 采用免疫組化鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結法(streptavidin-perosidase，SP)測定，Activin-A兔抗人多克隆抗體購自美國Santa Cruz生物技術公司，ACTR IIA、ACTR IIB鼠抗人多克隆抗體購自美國Upstate公司，稀釋度為1∶50，SP試劑盒(SP290001，SP29000)及二氨基聯苯胺(diaminobenzidine，DAB)試劑盒均購自北京中山生物技術公司。術中取得卵巢組織，使用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)沖洗，置于福爾馬林溶液，制備厚度為5 μm的石蠟切片，常規脫蠟處理，采用PBS 沖洗2次，每次5 min；采用檸檬酸緩沖液熱修復20 min，采用PBS 沖洗3 次PBS，每次5 min；采用3% 的雙氧水浸泡1 min后，以PBS 沖洗3 次，每次5 min；山羊血清封閉液靜置20 min后，加入一抗，以PBS代替一抗作為陰性對照、脂肪組織為陽性對照，4 ℃條件下過夜；采用PBS 沖洗3 次，每次5 min，二抗37 ℃條件下孵育20 min；采用PBS 沖洗3 次，每次5 min；酶標標記37 ℃條件下孵育20 min，采用PBS 沖洗3 次，每次5 min；DAB顯色，蘇木精復染細胞核，封片，顯微鏡下觀察，胞漿內呈棕黃色顆粒為陽性細胞，細胞漿內無棕色顆粒為陰性細胞。

1.2.3 卵巢組織ACTA、ACTR IIA、ACTR IIB mRNA表達檢測 采用RT-qPCR法，以Trizol 試劑盒(美國Invitrogen公司)提取卵巢組織總RNA，以分光光度計測定提取到的RNA 的純度及濃度，以4 μg RNA為模板逆轉錄成cDNA。25 μL PCR反應體系如下：模板cDNA 1 μL，5×Buffer 5 μL，dNTP mixture(10mM) 0.75 μL，Mg2+(250mM) 0.4 μL，正向、反向引物各0.5 μL，Eva green 1 μL，Taq酶 0.25 μL，加水補足至25 Tag μL，引物序列見表1。PCR反應條件如下：95 ℃ 5 min 預變性，95 ℃ 20 s 變性，58 ℃ 20 s 退火，72 ℃ 30 s 延伸，50個循環。電泳后采用TFP-M/WL核酸圖像分析儀(美國Vilber Lourmat公司)進行圖像掃描及拍照Opticon-2定量PCR儀產自美國MJ公司。

表1 RT-PCR反應引物序列

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 三組患者血清性激素水平比較

妊娠組、未妊娠組患者FSH水平均低于對照組，且妊娠組低于未妊娠組，差異具有統計學意義(P<0.05)；妊娠組、未妊娠組患者LH水平及LH/FSH值均高于對照組，且妊娠組高于未妊娠組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 三組患者血清性激素水平比較

2.2 三組患者卵巢組織ACTA、ACTR IIA、ACTR IIB免疫組化結果比較

免疫組化結果顯示，妊娠組、未妊娠組患者ACTA蛋白陽性率均高于對照組，且妊娠組高于未妊娠組，差異無統計學意義(P>0.05)；妊娠組、未妊娠組患者ACTR IIA、ACTR IIB蛋白陽性率均低于對照組，且妊娠組低于未妊娠組，差異無統計學意義(P>0.05)。見表3、圖1。

表3 三組患者卵巢組織ACTA、ACTR IIA、ACTR IIB免疫組化結果比較[n(%)]

2.3 三組患者卵巢組織ACTA、ACTR IIA、ACTR IIB mRNA相對值比較

RT-PCR結果顯示，妊娠組、未妊娠組患者ACTA mRNA相對值均低于對照組，且妊娠組低于未妊娠組，差異具有統計學意義(P<0.05)；妊娠組、未妊娠組患者ACTR IIA、ACTR IIB mRNA相對值均高于對照組，且妊娠組高于未妊娠組，差異具有統計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 三組患者卵巢組織ACTA、ACTR IIA、ACTR IIB mRNA相對表達值

2.4 相關性分析

PCOS患者ACTA表達水平與血清LH/FSH值呈負相關(r=-0.408，P<0.05)，PCOS患者ACTR IIA、ACTR IIB表達水平與血清LH/FSH值呈正相關(r=0.227，P<0.05；r=0.184，P<0.05)。

3 討論

PCOS是以內分泌紊亂為主、多種代謝異常導致的異質性臨床綜合征，其臨床特征之一為排卵障礙，可引起女性不育及月經稀發[5-6]。激活素是由抑制素的兩個β亞基通過二硫鍵連接而成的二聚多肽，屬于轉化生長因子β(TGF-β)超家族，最初因對垂體產生和分泌的促性腺激素具有促進作用而得名[7]。ACTA作為 TGF-β超家族成員之一，在卵泡發育和卵母細胞成熟中起著重要的調節作用[8]。Tanaka等[9]指出，隨著卵泡發育過程中卵泡環境由激活素主導向抑制素主導轉變，推測激活素在卵泡發育早期起重要作用。近年來研究[10]表明，PCOS發病可能與激活素水平異常及其下游信號通路的失調密切相關。在本研究中，PCOS妊娠組、未妊娠組患者ACTA 蛋白陽性表達率及mRNA相對值均低于對照組，ACTR IIA、ACTR IIB 蛋白陽性表達率及mRNA相對值均高于對照組，分析原因是由于激活素及其受體水平異常導致卵泡發育障礙，參與PCOS的發生發展。于春梅等[11]以20例PCOS患者為研究對象，發現其泡液中ACTA水平顯著高于正常婦女，并認為ACTA與卵泡發育有關；Wang等[12]指出，當體外培養12.5 dpc胎兒卵巢時，ACTA可通過增加減數分裂前基因和減數分裂基因的表達，促進卵原細胞減數分裂的啟動，也改善了原始卵泡的裝配，ACTA水平降低則不利于卵母細胞的存活和生長，與本文研究結論一致。研究[13]表明，ACTR IIA、ACTR IIB表達水平上升與胎兒生長受限相關。在本研究中同樣檢測到了PCOS患者ACTR IIA、ACTR IIB表達水平上升，而在本研究中檢測到的ACTA及ACTR呈現相反的趨勢，原因可能可能為ACTA主要通過與ACTR相互作用發揮其生物學效應，ACTA與ACTRII結合使ACTRI磷酸化，并與磷酸化的ACTRI聚合形成ACTRII-ACTA-ACTRI三元絡合物，當ACTA水平降低后，與之結合的ACTRII消耗量減少，導致組織中ACTRII含量升高[14]。

研究[15]表明，FSH降低、LH升高、LH/FSH比值降低是PCOS患者的特征表現。在本研究中，PCOS妊娠組、未妊娠組患者FSH水平均低于對照組，LH水平及LH/FSH值均高于對照組，與其他同類型研究結論一致。Spearman相關分析發現，PCOS患者ACTA表達水平與血清LH/FSH值呈負相關(P<0.05)，ACTR IIA、ACTR IIB表達水平與血清LH/FSH值呈正相關(P<0.05)，分析原因可能與ACTA對垂體、卵巢的旁分泌/自分泌調節作用相關。ACTA對FSH受體表達具有促進作用，并能夠抑制LH誘導的雄激素產生，因此，PCOS患者ACTA水平降低可引起FSH水平降低、LH升高，最終導致LH/FSH比值降低。于春梅等[11]指出，PCOS患者ACTA水平低于健康人群，且FSH呈降低趨勢，與本文研究結論基本一致。

除了參與PCOS的發生發展外，大量證據[16]表明，激活素在雌性哺乳動物的生殖發育中起著重要作用。也有研究表明，在14～21周胎兒卵巢中即可檢出激活素亞基及受體的表達，其中卵原細胞中可檢測到βA亞基，提示ACTA(βAβA)是妊娠期間母體循環中激活素的主要存在形式[17]。Funghi等[18]研究表明，從妊娠早期到妊娠28周，孕婦血清ACTA水平在整個妊娠過程中逐漸升高，然后急劇上升直至足月，分娩后則迅速下降，直至無法檢測到。在本研究中，PCOS未妊娠組患者ACTA蛋白陽性率及mRNA相對值均低于妊娠組，ACTR IIA、ACTR IIB及mRNA相對值均高于妊娠組，推斷ACTA及其受體表達水平與PCOS患者術后妊娠情況相關，分析原因可能是由于ACTA能夠促進垂體合成FSH，并對黃體生成激素對卵泡內膜細胞分泌雄激素進行抑制，而ACTA水平降低后對垂體、卵巢內分泌的調節所用失衡，不利于妊娠的發生、維持。另外，本研究的不足之處在于，采用免疫組化法測定ACTA、ACTR IIA、ACTR IIB陽性率時，雖然得出了與PCR法定量檢測一致的結果趨勢，但免疫組化法中不同組別間差異無統計學意義，分析原因與樣本量較少有關。

綜上所述，PCOS患者卵巢組織中ACTA水平降低，ACTR IIA、ACTR IIB水平升高，且均與LH/FSH值相關；此外，PCOS術后2年未妊娠患者卵巢組織中ACTA水平低于妊娠者，ACTR IIA、ACTR IIB水平高于妊娠者。ACTA及其受體可能作為有用的指標，用于輔助監測PCOS患者術后妊娠情況。