ST2抗體治療對KrasG12D非小細胞肺癌小鼠腫瘤標志物的水平和IL-33、ST2表達的影響

傳鋒彬，史紅陽，孔振興

(1.渭南市中心醫院呼吸與危重癥醫學科，陜西 渭南 714000；2.西安交通大學第二附屬醫院呼吸與危重癥醫學科；3.西安市第四醫院檢驗科，陜西 西安 710004)

肺癌是癌癥相關死亡的主要原因，患者5年平均生存率僅為約15%[1]。其中，非小細胞肺癌約占所有肺癌的80%。腫瘤標志物神經烯醇化酶(neuron-specific enolase，NSE)和癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)可用于非小細胞肺癌的早期診斷和病理類型鑒別[2]。非小細胞肺癌?；贙ras基因的驅動突變，與吸煙相關的人非小細胞肺癌中，超過25%與活化的Kras突變有關[3]。另有研究顯示，調節性T細胞(regulatory T cells，Tregss)可在人非小細胞肺癌早期和晚期中大量累積[4]。Tregss通過抑制效應T細胞，維持組織的完整性，并且短暫清除Tregss可有效降低機體的腫瘤負荷[5]。但是，完全清除Tregs也會誘發致命的自身免疫性疾病?，F有Tregs靶向治療，如CD25抗體治療，由于特異性較低，會使活化的效應T細胞耗竭[6-7]。因此，通過局部清除Tregs或優先靶向免疫抑制Tregs亞群來促進抗腫瘤免疫的有效策略具有重要意義。本研究擬檢測Kras突變非小細胞肺癌(KrasG12D)小鼠血清中NSE、CEA的水平，及其Tregs中ST2蛋白的表達；進一步探討ST2抗體治療對Kras突變非小細胞肺癌小鼠血清中NSE、CEA及其腫瘤負荷和抗腫瘤免疫反應的作用，以期為治療Kras突變的非小細胞肺癌中活化的Tregs提供一定的實驗依據。

1 材料方法

1.1 主要試劑

CD25(PC61)、CD4(RM4-5)、Foxp3(FJK-16s)、ST2(RMST2-2)、NK1.1(PK136)和PD1(J43)抗體購于美國BD生物科學公司。同型對照免疫球蛋白購于武漢艾美捷科技有限公司。

1.2 實驗小鼠分組

40只健康雄性KrasG12D非小細胞肺癌小鼠及8只對照野生型(wild type，WT)非小細胞肺癌小鼠購于美國Jaxlab公司，在SPF清潔級環境下飼養。40只KrasG12D小鼠隨機分為5組，每組8只；ST2抗體治療實驗中，隨機選取2組KrasG12D小鼠在18周時分別給予腹腔注射ST2抗體(1.5 mg·kg-1·d-1)或同型對照免疫球蛋白(1.5 mg·kg-1·d-1)，連續3周，WT組注射同型對照免疫球蛋白(1.5 mg·kg-1·d-1)。結束后各組小鼠處死。

1.3 酶聯免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)

分別在6周、12周和18周時采用小鼠酶聯免疫吸附試驗試劑盒檢測小鼠血清中NSE、CEA水平，操作過程嚴格按照說明書進行。

1.4 流式細胞術

提取小鼠肺腫瘤組織，磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffer salin，PBS)灌洗后，用0.1 mg/mL膠原酶IV在37 ℃消化30 min，然后用70 μm尼龍網對肺組織進行機械分離，1 000 rpm離心20 min，獲得單個核細胞。

對分離出的細胞進行流式細胞儀分析。采用FACSCalibur流式細胞儀(美國BD公司生產)測定Tregs細胞的表達水平，CD4-FITC+CD25-PE+Foxp3抗體標記Tregs細胞，并進一步檢測Tregs細胞中CD4-FITC+CD25-PE+Foxp3+ST2、CD4-FITC+CD25-PE+Foxp3+NK1.1、CD4-FITC+CD25-PE+Foxp3+PD1的表達，調整細胞濃度，將100 μL以上熒光抗體加入對應單個核細胞內，室內避光孵育1 h，沖洗(PBS緩沖液)，將破膜劑加入，再次避光孵育15 min，PBS沖洗后上機收集細胞流式細胞儀進行檢測，檢測過程嚴格按照說明書進行。

1.5 實時熒光定量聚合酶鏈式反應(quantitative real-time polymerase chain reaction， RT-qPCR)

通過氣管插管收集1 mL PBS液獲得各組小鼠支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)，1 200 rpm離心10 min后獲得BALF液，并收集小鼠肺組織樣本分別進行核糖核酸(ribonucleic acid，RNA)分析，用組織勻漿器在Trizol試劑中分離肺組織mRNA，BALF細胞直接置于Trizol中。采用SYBR預混料和Bio-Rad實時熱循環系統進行RT-qPCR實驗檢測轉錄產物。以磷酸甘油醛脫氫酶基因為標定基因，基因的相對表達量用2-ΔΔCT表示。引物序列見表1。

表1 RT-qPCR過程中的引物序列

1.6 統計學分析

2 結果

2.1 KrasG12D小鼠血清NSE、CEA的水平和肺腫瘤浸潤中Tregs的比例

與WT組相比，KrasG12D小鼠血清中腫瘤標志物NSE和CEA的水平隨著周齡的增長不斷提高(P<0.05)。流式細胞術結果顯示，KrasG12D小鼠肺CD4 T細胞中的Tregs比率也隨著腫瘤進展的推移而不斷增加(P<0.05)。見表2。

表2 KrasG12D小鼠血清NSE、CEA水平和肺腫瘤浸潤中Tregs比例

2.2 Kras突變非小細胞肺癌中CD4+Foxp3+ T細胞ST2表達

KrasG12D小鼠肺腫瘤中Tregs細胞中CD25和ST2呈高表達(P<0.05)，見圖1A。隨著周齡的增長和腫瘤的發展，KrasG12D小鼠肺組織中和BALF液中的白介素33(interleukin-33，IL-33)表達水平均顯著增加(P<0.05)，見圖1B。

2.3 ST2抗體治療后Kras突變非小細胞肺癌中活化Tregs的比例

與陰性對照組相比，給予抗ST2抗體治療的KrasG12D小鼠的肺中表達ST2的Tregs顯著減少(P<0.05)。見圖2。

2.4 ST2抗體治療后KrasG12D小鼠血清中NSE、CEA水平和抗腫瘤免疫反應

ST2抗體治療后KrasG12D小鼠血清中NSE和CEA的水平顯著降低(P<0.05，表3)。此外，KrasG12D小鼠肺腫瘤中NK1.1細胞比率降低，PD-1水平增加，并且經ST2抗體治療后小鼠肺中的NK1.1細胞比率增加而PD-1水平降低(P<0.05)。

表3 ST2抗體治療KrasG12D小鼠NSE、CEA水平和抗腫瘤免疫反應

3 討論

致癌的Kras突變被認為是30%的非小細胞肺癌的始動因素，且在沒有進行靶向治療時與不良預后密切相關[8]。與許多惡性腫瘤一樣，非小細胞肺癌是一種異質性疾病，包括多種特異組織學亞型，具有獨特的分子特征[9]。由于非小細胞肺癌亞型的突變特征不同，免疫細胞組成和激活狀態也不同，目前臨床上尚無針對Kras突變的非小細胞肺癌靶向治療，盡管針對非小細胞肺癌治療的早期干預比晚期轉移性腫瘤的治療更有效。因此，探索有效的靶向治療手段尤為困難，進而促使研究Kras突變肺腫瘤的特異免疫成分以用于臨床治療具有一定的前瞻性。

近年來，免疫治療的進展為癌癥靶向治療提供了新思路，使用合適的臨床前癌癥模型開發和測試新藥物至關重要。由于自發癌癥的基因工程小鼠模型具有可再現人類癌癥，并激活宿主免疫系統對抗內生的腫瘤等優勢，本研究使用了KrasG12D肺癌小鼠模型，發現Tregs在其肺腫瘤組織中明顯富集，促使小鼠的非小細胞肺癌不斷進展，這可能是由于Tregs在腫瘤發展過程中與抗腫瘤的免疫反應有關Tregs[10-11]。ST2是IL-33的受體，與脂肪組織、腸和肌肉中激活的組織中的Tregs密切相關[12]。在流感感染的致病環境中，ST2表達的Tregs已被證明是維持組織完整性的關鍵介質[13]。人肺腺癌標本中IL-33表達水平升高，可能會誘導在肺癌中ST2表達的Tregs的水平增加[14]。在整體或Tregs特異性ST2缺失動物模型中，Tregss中ST2的表達可促進結直腸癌的免疫抑制環境[15]。本研究檢測了局部消除腫瘤浸潤的Tregs。結果顯示，在腫瘤進展過程中，ST2表達的Tregs在肺腫瘤組織中高度富集，Tregs并且KrasG12D小鼠肺中IL-33的表達水平也顯著增加。

Tregs中ST2的表達僅限于肺腫瘤組織，而在次級淋巴器官中幾乎不存在，為探究局部Tregs是否可以被特異性抑制，以及KrasG12D小鼠中局部Tregs是否是腫瘤免疫監測的積極參與者，本研究還采用抗ST2抗體治療KrasG12D小鼠3周，在肺腫瘤部位實現活化的Tregs消除，證實了Tregs中ST2對抗腫瘤免疫的阻礙作用，表明ST2抗體治療可有效地選擇性清除腫瘤浸潤激活的Tregs，降低腫瘤負擔，增強抗腫瘤免疫反應，并降低血清中腫瘤標志物NSE、CEA水平。因此，靶向表達Tregs中ST2可以控制KrasG12D肺癌小鼠腫瘤負擔以及血清中NSE、CEA水平。

KrasG12D小鼠模型肺中ST2的表達為探討清除腫瘤浸潤的Tregs在自發性肺癌治療中的作用提供了新的實驗證據。然而，Tregs的長期缺失可誘導系統效應輔助性T細胞(helper T cell，Th細胞)反應增加，進而導致過度炎癥反應和自身免疫性疾病?？墒?，免疫細胞的系統激活也需要持久的免疫反應。因此，應進一步研究局部Tregs的清除或Tregs的短暫抑制與全身免疫調節藥物聯合應用的治療可能性。本研究顯示KrasG12D小鼠ST2抗體治療后抗腫瘤免疫反應增強，但不能排除ST2抗體治療以KrasG12D肺癌小鼠中Tregs以外的細胞成分為靶點，從而導致腫瘤抑制和血清標志物降低的可能性，這也是本研究的局限性，后續需做進一步的探索。

綜上， KrasG12D非小細胞肺癌小鼠血清NSE、CEA水平上調，腫瘤過度浸潤Tregs，ST2表達增加，ST2抗體治療可顯著清除肺腫瘤中活化的Tregs，增強抗腫瘤免疫反應，降低血清中NSE、CEA水平。靶向表達ST2的Tregs可能是非小細胞肺癌潛在的新治療靶點。