非小細胞肺癌原發和繼發T790M突變的臨床病理特征

吳彬，李玉強

(錦州醫科大學附屬第一醫院臨床生物樣本中心，遼寧 錦州 121000)

在全世界范圍內，肺癌是最為常見的惡性腫瘤，其死亡率排在所有癌癥的第一位[1-2]。非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)一般占到原發性肺癌的80%～85%，但其5年生存率較低，不足20%[3]。酪氨酸激酶在腫瘤的發生發展中發揮著極其重要的作用，以其為藥物靶點的表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitors，TKIs)一直是抗腫瘤藥物研發的重點，隨著這個領域的不斷成熟，EGFR-TKIs成為治療NSCLC患者的重要手段，然而，幾乎所有患者在應用 EGFR-TKIs 治療后一年均會面臨耐藥的問題。EGFR-TKIs耐藥的機制有很多，包括EGFR T790M突變的出現，MET擴增，組織學轉化以及KRAS，BRAF或PIK3CA的突變[4-5]，其中T790M 突變是最常發生的耐藥機制，不僅是導致繼發耐藥的主要原因[6]，一代和二代EGFR-TKIs原發[7]或繼發耐藥也都與之相關。近年來原發T790M突變隨著檢測技術的發展和檢測方法的更新，其檢出率表現出明顯的增加趨勢[8-10]。繼發T790M突變往往得到臨床的普遍關注和重視，而對原發T790M突變忽視或關注度不夠，同時大部分研究是從繼發T790M角度對各種肺癌臨床進行分析研究，鮮有對原發與繼發T790M突變兩者在臨床病理上的分析研究。本研究使用ARMS法檢測原發和繼發T790M的突變狀態，并分析其與臨床病理特征的關系，從而為選擇后續治療方案提供理論依據。

1 對象與方法

1.1 研究對象

由2014年1月至2018年12月錦州醫科大學附屬第一醫院收治住院，行腫物活檢、手術切除或胸腔積液抽取，并于病理科確診為NSCLC的患者中篩選研究病例374例，將年齡、性別、病理組織分型、吸煙史及臨床分期等臨床病理特征建立成資料庫。參照2015年世界衛生組織(WHO)及國際肺癌研究協會(IASLC)共同修訂的肺和胸膜腫瘤分類標準確定病理組織分型，根據國際抗癌聯盟(UICC)于2017年1月頒布實施的最新版肺癌TNM分期標準確定臨床分期。納入標準：(1)初次行EGFR檢測的病例從尚未進行過化療或者已經進行過化療，但是沒有毒副作用干擾的患者中選取，化療對基因表達情況不產生影響[11]；(2)所有非原發T790M突變患者均有 EGFR基因18、19或者21 外顯子上敏感位點的突變，并接受EGFR-TKIs(如吉非替尼、埃克替尼等靶向藥)治療。在病情有所進展后，通過穿刺手術取得患者活檢新鮮組織或胸腔積液再次檢測EGFR 基因突變情況，根據檢測結果將患者分為T790M 突變組和無 T790M 突變組；(3)臨床表征不足(年齡，性別，吸煙狀況，組織學，疾病分類)的患者被排除在研究之外；(4)年齡≥18歲，且自愿簽署知情同意書。每例標本的病理組織學診斷均由兩位高年資病理科醫師進行評估。研究經我院倫理委員會批準，并征得患者或家屬的知情同意。

1.2 突變擴增阻滯系統 (amplification refractory mutation system， ARMS)法檢測突變

應用ARMS-PCR法(ABI 7500 熒光定量PCR儀，美國應用生物公司)對EGFR基因進行檢測，檢測范圍涵蓋18、19、20和21這4個外顯子上的29個熱點突變(ADx-ARMS，艾德，YZB/國6377-2014)。根據EGFR檢測試劑盒的說明書來設置反應參數，所有實驗都設有陽性對照和陰性對照，保證結果的準確性。最終根據PCR的擴增曲線及CT值的cut-off值對結果進行判讀。

1.3 統計學方法

采用SPSS 22.0軟件進行統計分析。比較原發與繼發T790M突變與 NSCLC 患者臨床病理特點的關系時，計數資料采用(%)表示，行連續校正χ2檢驗或Fisher精確概率法(Fisher’s exact test)，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 臨床病理特征

374例NSCLC患者中先后發生T790M突變的共197例，其中女性T790M突變率高于男性(54.3%>45.7%)；中位年齡為59歲(27～88歲)，小于61歲占比46.7%，大于等于61歲占比53.3%；吸煙患者占比41.7%，不吸煙占比58.4%；病理組織分型中腺癌占比60.9%，非腺癌占比39.1%；TNM分期中Ⅰ～Ⅱ期占比38.6%，Ⅲ～Ⅳ期占比61.4%。T790M突變情況與性別、年齡、吸煙史等方面的差異無統計學意義(P>0.05)，與病理組織分型及TNM分期有統計學意義(P<0.05)，見表1。在374例NSCLC患者中，首次進行EGFR檢測陰性結果有177例，在疾病進展后再次行EGFR基因檢測，均無T790M突變情況。

2.2 原發與繼發T790M突變與基因特征的相關性分析

在選取的374例非小細胞肺癌患者初次進行EGFR檢測的結果中發現單獨L858R發生突變168例，占非小細胞肺癌患者突變總數的44.9%；單獨19-del發生突變159例，占非小細胞肺癌患者突變總數的42.5%；罕見突變36例，占非小細胞肺癌患者突變總數的9.6%；雙突變共11例，占非小細胞肺癌患者突變總數的3%，其中T790M伴L858R突變的7例，T790M伴19-del突變的4例。初次行EGFR檢測未發生T790M突變的患者接受吉非替尼、厄洛替尼或埃克替尼治療后，病情進展再次進行T790M突變的檢測，發現T790M突變186例，其中合并L858R突變的50例，合并19-del突變的136例。結果顯示，T790M突變常和EGFR致敏突變一同出現，在原發T790M突變人群中，與19-del比較，L858R突變常合并T790M突變(63.6% vs 36.4%)，而這一比例在繼發T790M突變人群中恰恰相反為26.9% vs 73.1%，原發和繼發T790M突變在L858R和19-del分布差異存在統計學意義(P=0.009)。

表1 NSCLC患者T790M突變與臨床病理特征的關系

3 討 論

近年來對于非小細胞肺癌靶向藥物的研究隨著精準醫療時代的到來也變得越來越深入。其中靶向治療的耐藥性給患者的治療帶來了極大的難題，因此耐藥的研究被越來越多的專家學者所重視。EGFR基因21號外顯子上L858R敏感點突變以及19號外顯子上19-del缺失突變這兩種常見突變在臨床上已經有較為深入的研究，而針對EGFR T790M突變與臨床病理特征及分子改變情況的研究還不是很多。研究報道繼發T790M突變率基本在一定范圍內，為45%～60%之間[12-13]，本研究中繼發T790M突變率為49.7%，與文獻報道一致。然而原發T790M突變率的數值波動范圍較大，在不同研究中數值差異很大，從較低的1%到80%[14-15]。導致原發T790M突變發生率波動范圍較大原因可能如下：(1)檢測技術，Sanger法檢測EGFR突變人群原發T790M突變發生率在1%～8%[16-18]， AMRS法檢測敏感性在2.75%～6.91%。本研究采用ARMS法進行檢測，檢出原發T790M突變率為3%，在文獻報道范圍內；(2)檢測標本，原發T790M在新鮮冰凍標本的突變率高于石蠟包埋福爾馬林固定標本[19]。雖然原發性EGFR T790M在臨床上是一種少見的情況，但針對這部分患者的治療方案還需要進一步深入研究。隨著檢測技術的不斷發展，原發T790M的檢出率也在不斷增加，在臨床治療和指導預后等方面發揮著越來越重要的作用。

本研究在374例非小細胞肺癌患者中描述了含有原發與繼發EGFR T790M突變患者的臨床病理及分子特征。盡管T790M突變可以誘導EGFR-TKIs類藥物耐藥，但是它或許并不能成為誘發腫瘤的獨立因素，必須與19外顯子缺失及L858R突變共存才能誘導腫瘤發生。本研究中原發T790M突變常合并L858R并存，而繼發T790M突變常合并19-del并存，針對這一研究結果的解釋是19-del較L858R對TKIs敏感性更高[20]，經EGFR-TKIs治療后T790M兩次突變或亞克隆更容易在19-del中富集，另一種解釋是L858R突變在促進腫瘤形成中需要更多其他基因改變協助完成。

總之，原發與繼發性T790M突變檢測在肺癌患者中具有巨大的潛在臨床應用價值，隨著這一研究領域的不斷發展，為患者跟蹤檢測T790M的動態變化，不僅能及時評估靶向藥物的療效以及預后，同時有利于復發和轉移的及早發現，更為患者治療方案的合理化及個體化提供強有力的理論依據。然而由于本研究為小樣本量的回顧性研究，缺乏大量的研究數據予以支撐結論，因此對非小細胞肺癌患者T790M突變的動態改變在臨床治療中的作用尚需進一步研究證實。我們認為對原發和繼發T790M突變進行大樣本的篩查研究十分必要，希望可以明確闡釋T790M動態變化患者的臨床病理特征及分子改變的相關性。