無創假陰性2家系研究*

陳運春，黃盱寧，孔嫦瑛，胡建東

1.海南省海口市中醫醫院檢驗科，海南海口 570216；2.海南省海口市中醫醫院內科，海南海口 570216；3.海南醫學院第二附屬醫院超聲醫學科，海南海口 570311；4.海南醫學院第二附屬醫院婦產科，海南海口 570311

無創DNA產前檢測技術(NIPT)通過采集孕婦靜脈血來檢測胎兒是否患3種常見胎兒染色體非整倍體異常：21-三體綜合征(Down綜合征)、18-三體綜合征(愛德華氏綜合征)、13-三體綜合征(Patau綜合征)。先天性心臟病(CHD)是一種常見的先天畸形，是由原發性胚胎發育異常所致的心臟和胸腔內大血管結構異常，其發病率在活產新生兒中占0.5%～1.0%，在死胎中可高達3.0%[1]。本文對2例無創檢查陰性伴CHD的先證者及父母進一步行細胞遺傳學檢查，進行觀察性研究分析，探討其成因及對策。

1 資料與方法

1.1一般資料 對2例無創檢查陰性伴CHD的先證者及父母進一步行細胞遺傳學檢查，本研究經患者本人知情同意，未違反醫學倫理學原則。

1.1.1病例1 先證者B超檢查：中晚孕Ⅲ級產科(系統超聲)，子宮增大，宮內見單胎，頭位。胎兒測量參數，雙頂徑51 mm，頭圍185 mm，腹圍174 mm，股骨長度36 mm，胎兒體質量估測(447±65)g。胎頭橢圓形，顱骨環完整。顱內結構兩側對稱，腦中線居中，腦室無增寬。小腦半球大小形態正常。頸項皮層厚約8 mm。胎兒上唇皮膚連續，雙眼玻璃體，鼻可見。胎兒脊柱邊緣連續。胎兒胸腔未見明顯異常液區，心胸增大，以右心增大明顯。心臟四腔心切面可顯示，左右心腔不對稱，三尖瓣均可見開放及關閉運動，二尖瓣未見開放、關閉運動。右室流出道切面可顯示，左室流出道未顯示，三血管切面僅見1條大動脈回聲，胎心率138次/分，律齊。胎兒腹腔未見異常液性區。胃泡和膀胱可顯示。雙腎臟可顯示，形態飽滿，雙腎回聲彌漫性增強。胎兒上肢肱骨、尺骨及橈骨可顯示；雙手呈外翻狀，姿勢固定無變化，胎兒下肢股骨、脛骨及腓骨可顯示。胎盤附著于子宮前壁，厚26 mm，成熟度0級，下緣覆蓋宮頸口。臍帶入口位于胎盤邊緣。羊水最大深度 47 mm，透聲好，臍動脈一條，未見臍帶繞頸。臍動脈S/D=2.72。確診CHD后于外院行引產術。

1.1.2病例2 先證者A型血，RhD陽性，RhC陽性，RhE陽性。乙型肝炎病毒血清學標志物5項檢測：抗-HBc陽性，余陰性。丙型肝炎病毒陰性，人免疫缺陷病毒陰性，梅毒螺旋體抗體(TPPA)陰性。血常規正常。孕36+2周順產出生，出生1 d住院診斷：CHD、房間隔缺損、室間隔缺損、隱睪、新生兒視網膜病變。查體：出生體質量1.8 kg，簡易胎齡評分：足底紋理2分+乳頭形成1分+指甲1分+皮膚組織2分+27分=33周。查血常規：白細胞計數12.14×109/L，血紅蛋白175 g/L，血小板計數158×109/L。

彩色多普勒超聲檢查，超聲測值：主動脈瓣環4 mm，主動脈竇部7 mm，升主動脈7 mm，肺動脈10 mm，降主動脈5 mm；左房前后徑11 mm，室間隔3 mm，左室舒張末期14 mm，左室舒張末期14 mm，左室后壁5 mm，右室前后徑8 mm。2D及M型特征：心房正位，心室右襻，房室連接及大血管連接關系正常，左心稍大，右心房腔內徑正常；右室壁增厚約3 mm，室壁運動收縮幅度尚正常；室間隔主動脈瓣下回聲中斷約7 mm，房間隔中部回聲中斷約7 mm，各瓣膜形態結構正常，啟閉尚可；降主動脈與肺動脈之間可見異常通道，寬約5 mm；心包腔內未見異常回聲。彩色及頻譜多普勒特征：瓣口流速M/S，二尖瓣1.0，三尖瓣0.9，主動脈1.1，肺動脈瓣1.8；房水平可見左向右為主的雙向分流，室水平可見左向右為主的雙向分流，流速均約1.0 m/s；降主動脈與肺動脈之間異常通道內似可見右向左藍色血流，二尖瓣少量反流，三尖瓣少量反流，峰值流速約3.1 m/s；峰值壓差約38 mm Hg，估測肺動脈收縮壓約43 mm Hg；心內余瓣口未見異常彩色湍流信號。

1.2儀器與試劑 二氧化碳培養箱，北昂(BEION)染色體核型分析系統，張氏培養基，人體外周血淋巴細胞培養基(廣州拜迪生物醫藥有限公司)、低滲液(0.075 mol/L的KCl溶液)、10 μg/mL的秋水仙素、固定液(甲醇、冰醋酸)、磷酸鹽緩沖液、胰蛋白酶、吉姆薩染液。

1.3方法 取肝素抗凝外周血1.5 mL，接種含30%小牛血清的RPMI 1640培養基，37 ℃經72 h培養，收獲，G顯帶。羊水離心后取沉淀加張氏培養基5 mL混勻，接種25 cm2培養瓶，二氧化碳培養箱開放式培養，8～10 d收獲，G顯帶。北昂(BEION)染色體核型分析系統計數30個分裂相，分析3～5個核型，視異常情況進一步加大計數100個分裂相、全基因組測序。核型描述參考人類細胞遺傳學命名國際體制(ISCN2016)。

2 結 果

2.1病例1 先證者羊水染色體核型46，XY，der(8)t(6;8)(q23;p23)pat，1qh+pat。父母體健，非近親結婚，無遺傳病史，孕1產0。父母備孕前均未做染色體檢查，遵孕期要求，做過無創產前DNA檢測結果為陰性。父親，男，33歲，表型正常，染色體核型:46，XY，t(6；8)(q23；p23)，1qh+，經《中國人類染色體異常核型數據庫》鑒定專家組鑒定，查詢《Cytogenetics Database》《中國人類染色體異常核型數據庫》均未見相關報道，收錄入《中國人類染色體異常核型數據庫》，數據庫編號：4058。母親表型正常，染色體核型:46，XX。

2.2病例2 先證者染色體核型為46，XY，der(6)t(6；22)(p25；q11.2)pat。父母體健，非近親結婚，無遺傳病史，母親孕期服藥史不詳，孕2產1。父母備孕前均未做染色體檢查，遵孕期要求，做過無創產前DNA檢測結果為陰性。患兒父親染色體結果為46，XY，t(6；22)(p25；q11.2)，母親染色體結果為46，XX。

先證者全基因組測序結果：未發現染色體非整倍體變異及與受檢者臨床表型相關的已知的、致病性明確的100 kb以上的微缺失/微重復變異。經過與臨床診斷對照，患兒的心臟缺陷有可能與第6號染色體短臂部分(63810-251901)片段缺失有關，房間隔缺損有可能與第17號染色體長臂部分(34434626-34628911)片段重復有關，如果要明確診斷還需要做進一步的檢測確診。

2.32家系情況對比結果 見表1。

表1 2個家系情況對比表

3 討 論

NIPT通過采集孕婦靜脈血，利用新一代DNA測序技術對母體外周血漿中的游離DNA片段(包含胎兒游離DNA)進行測序，并將測序結果進行生物信息分析，可以從中得到胎兒的遺傳信息，從而檢測胎兒是否患三大染色體病。無創DNA產前檢測不是一個診斷性試驗，導致不一致結果發生的主要原因是由于循環游離DNA(cfDNA)主要來自于胎盤絨毛的細胞滋養層細胞，后者并不總是能夠代表胎兒情況，在真正的嵌合體(TFM)中，細胞滋養層細胞核型正常，而胎兒本身則為異常核型，胎兒胎盤嵌合是cfDNA檢測結果與實際情況不符的主要生物學原因之一，這將導致NIPT假陰性結果。

CHD的發病機制不甚清楚，可能與染色體異常、基因突變、病毒感染及環境因素等有關。有研究認為，早期對先天性心臟畸形胎兒染色體異常作出診斷，對產前預測繼續妊娠或下次妊娠的風險至關重要[2-4]。胎兒先天性心臟畸形以復雜畸形多見，合并心外畸形的發生率很高，染色體異常的發生率亦較高，且以18-三體綜合征為主。多項研究認為，21-三體綜合征可能是中國人群CHD胎兒染色體異常的常見類型[5-8]，而本文2例CHD病均伴以衍生染色體，臨床少見，且衍生染色體均來自其父，由于其遺傳物質的不平衡，而表現出較嚴重的臨床癥狀，智力低下或伴多發畸形。

盡管胎兒超聲檢查的廣泛應用可以獲得相應的胎兒產前影像學資料，但這不是確診的標準。由染色體異常引起的CHD約占5%，進一步進行遺傳學檢測及遺傳咨詢是必需的。張婧等[9]研究顯示，WHO將預防措施分為三級預防:(1)一級預防，即孕前預防，針對導致CHD的原因及可能的危險因素，在孕前采取各種有效措施；(2)二級預防，提高產前診斷技術，選擇性終止妊娠，減少CHD的發生(如病例1)；(3)三級預防，對出生后患兒的各種畸形進行積極、及早的治療，提高生存質量(如病例2)。

通過對本文2家系的情況進行研究分析提示，臨床工作中要注意掌握NIPT適應證，父母有染色體異常攜帶其本身是NIPT的不適用人群，不應該行NIPT，而應直接行核型的產前診斷。故建議要強調行婚前體檢的染色體檢查，及早檢出染色體異常，對父母為染色體畸變核型攜帶者提前干預，可直接選擇做第3代試管嬰兒，選擇性生育，避免缺陷患兒出生，避免家庭陷入巨大的精神和經濟壓力。