NLRP3炎癥小體與葡萄膜炎的關系

荊 鋒，宋志紅

陜西省渭南市大荔縣醫院：1.眼科;2.外三科,陜西渭南 715103

葡萄膜炎是臨床中常見的致盲性眼科疾病，主要累及葡萄膜、視網膜、視網膜血管與玻璃體。該病好發于青壯年，病情較長，且存在反復發作等特點，治療難度較大[1]。有研究指出，葡萄膜炎在我國致盲性眼病中排4～7位[2]。有研究指出，我國葡萄膜炎疾病中以Behcet病與Vogt-小柳原田綜合征(VKH))為主[3]。目前，多數研究認為葡萄膜炎是一種炎癥性疾病與免疫性疾病，但具體病因至今仍不明確，但大多數學者認為感染與免疫反應參與葡萄膜炎的發生[4-5]。隨著醫學技術的不斷發展，作為固有免疫系統的重要組成部分，核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3(NLRP3)炎癥小體被認為參與了多種疾病的發生與預后，其在眼科疾病中的作用亦被多數學者認可，但其在葡萄膜炎中的的作用臨床中研究較少。故筆者結合自身臨床實踐選取290例葡萄膜炎患者作為研究對象，旨在研究NLRP3在葡萄膜炎發生及預后中的作用，旨在為臨床中該病患者診斷治療提供幫助，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2019年4月至2020年2月本院收治的葡萄膜炎患者290例作為觀察組，另選取同期在本院體檢健康者280例作為對照組。觀察組男155例，女135例，年齡26～42歲，平均(32.33±4.68)歲，均為中間型葡萄膜炎患者；對照組男143例，女137例，年齡25～43歲，平均(32.87±4.73)歲。2組性別、年齡等一般資料比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究獲得本院倫理委員會批準通過。

1.2納入及排除標準 納入標準：(1)本研究獲得患者或其家屬同意，并簽署知情同意書；(2)玻璃體炎性細胞多于前房炎性細胞、玻璃體內典型雪球狀混濁、特征性雪堤樣病變、伴有后囊下白內障、黃斑囊樣水腫、視盤炎、視網膜周邊血管炎等患者。排除標準：(1)有其他眼科疾病如青光眼、結膜炎等患者；(2)患有嚴重的免疫疾病者；(3)患有精神抑郁類疾病或是長期服用相關藥物者；(4)患者存在眼部疾病史或手術史者。

1.3方法

1.3.1試劑與儀器 4 ℃低溫高速離心機購自長沙東旺實驗儀器有限公司，熒光定量PCR儀購自西安天隆科技有限公司，酶標儀購自上海賽默科技生物發展有限公司，淋巴細胞分離液購自北京百奧萊博科技有限公司，酶聯免疫吸附試劑盒購自南京信帆生物技術有限公司，RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒、PCR擴增試劑盒均為天根生化科技(北京)有限公司生產。

1.3.2標本采集 抽取受試者清晨空腹靜脈血6 mL共分為2份，1份至于室溫下凝血后采用3 000 r/min離心10 min得到血清；另1份用肝素抗凝后，加入淋巴細胞分離液后離心，抽取懸浮于中層的單個核細胞備用。取血清標本按照酶聯免疫吸附試劑盒說明書中步驟，配置蛋白濃度梯度標準品、適當稀釋血清標本，隨后進行點樣抗體孵育、洗板等操作，最后在酶標儀上讀取450 nm處的吸光值(A450)，對白細胞介素(IL)-1β表達水平進行記錄觀察。取外周血單個核細胞，采用RNA抽提試劑盒提取細胞中的RNA，隨后紫外分光光度計測定濃度后取2 μg RNA進行反轉錄，得到cDNA樣本后即逆行PCR擴增，NLRP3引物序列參考文獻[6]，經溶解曲線驗證后用于實驗。

1.4觀察指標 檢測2組受試者NLRP3表達與IL-1β水平，隨后根據文獻[6]標準對患者疾病嚴重程度進行評分，結膜睫狀充血記1分，房水細胞或房水閃輝陽性記1分，角膜后沉著物記1分，虹膜粘連記1分，伴玻璃體細胞、黃斑囊樣水腫、并發白內障或繼發性青光眼等并發癥的其中任何一項記1分，計算患者總得分，并分析評分與NLRP3、IL-1β的相關性。對觀察組患者隨訪3個月，根據其治療效果分為預后良好組、預后較差組。療效判定根據本院自制的標準進行，預后良好組：患者臨床癥狀表現消失，視力提高1～3行，3個月內無復發；預后較差組：患者臨床癥狀無明顯改善，視力無明顯提高或下降，眼底熒光血管造影視網膜血管滲漏有所減輕，但改善程度較小。分析2組患者NLRP3、IL-1β表達情況，采用受試者工作特征曲線(ROC曲線)分析NLRP3與IL-1β對預后良好患者的預測價值。

2 結 果

2.12組NLRP3相對表達水平與IL-1β水平比較 觀察組NLRP3相對表達水平[(245.43±30.58)]、IL-1β水平[(78.73±9.08)ng/L]均高于對照組[(105.33±14.85)、(13.84±2.03)ng/L]，差異均有統計學意義(t=69.187，P<0.001；t=116.794，P<0.001)。見圖1。

2.2觀察組患者疾病嚴重程度與NLRP3、IL-1β的相關性 290例患者疾病嚴重程度評分為(4.61±1.27)分，采用Pearson相關分析顯示，疾病嚴重程度評分與NLRP3、IL-1β均呈正相關。見圖2、3。

圖1 觀察組與對照組NLRP3相對表達水平及IL-1β水平柱狀圖

圖2 疾病嚴重程度評分與NLRP3的相關性

圖3 疾病嚴重程度評分與IL-1β的相關性

2.3隨訪3個月預后良好組與預后較差組患者NLRP3相對表達水平及IL-1β水平比較 隨訪3個月預后良好組患者188例，預后較差組患者102例，預后良好組患者NLRP3相對表達水平[(155.32±25.38)]、IL-1β水平[(43.28±7.65)ng/L]均低于預后較差組[(193.27±28.82)、(58.39±8.66)ng/L]，差異均有統計學意義(t=9.561，P<0.001；t=12.653，P<0.001)。見圖4。

圖4 預后良好組與預后較差組NLRP3相對表達水平及IL-1β水平柱狀圖

2.4NLRP3、IL-1β對預后良好患者療效的預測價值 采用ROC曲線分析NLRP3、IL-1β對預后良好患者療效的預測價值，結果顯示，NLRP3、IL-1β預測預后良好組患者的AUC為0.884(95%CI：0.835～0.934)、0.880(95%CI：0.832～0.928)，最佳臨界值為178.52、51.17 ng/L，靈敏度為88.6%、84.1%，特異度為78.4%、82.4%。見表1、圖5。

表1 NLRP3、IL-1β對預后良好患者療效的預測價值

圖5 NLRP3、IL-1β對預測預后良好組患者療效的ROC曲線圖

3 討 論

葡萄膜炎的發病機制至今未得到證實，但多數學者認為與自身免疫功能紊亂有較強的關系，且動物實驗也證明，免疫應答、花生四烯酸、前列腺素、白三烯等炎癥因子的釋放會導致葡萄膜炎的發生[7-8]。隨著臨床研究的不斷深入，NLRP3炎癥小體進入學者視線，有較多研究指出，NLRP3參與多類眼部疾病的發生及疾病進展[9-11]。另有研究指出，NLRP3炎癥小體可活化IL-1β等細胞因子前體，使其成熟并釋放[12-13]，而IL-1β在葡萄膜炎中的作用亦十分重要，葡萄膜炎患者IL-1β水平會隨著疾病的進展應激性增高[14]。

本研究顯示，觀察組患者NLRP3相對表達水平與IL-1β水平均高于對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)，表明葡萄膜炎患者發病后NLRP3與IL-1β水平均會出現應激性升高。有研究指出，葡萄膜炎患者NLRP3與IL-1β水平可出現顯著升高，這主要是因NLRP3激活Toll樣受體3/4通道，引起人體炎性反應，隨著疾病的進一步發展，活性氧簇被激活，導致IL-1β細胞因子前體被活化并大量釋放，最終引起NLRP3與IL-1β表達水平提升[15-16]。此外，活性氧簇可通過硫氧蛋白相互作用蛋白激活NLRP3炎癥小體，即當活性氧簇水平升高時，掌握人體氧化能力的氧化還原酶硫氧還蛋白自生發生解離，而作為上配體的NLRP3因此得到激活，刺激其下游炎癥小體IL-1β水平提升，從而導致葡萄膜炎的發生與疾病進展[17]。

本研究對患者疾病嚴重程度評分與NLRP3、IL-1β相關性分析顯示，疾病嚴重程度評分與NLRP3、IL-1β均呈正相關，表明NLRP3與IL-1β參與患者疾病進程。本研究對患者隨訪3個月發現，預后良好組患者NLRP3與IL-1β水平均低于預后較差組。ROC曲線分析顯示，NLRP3、IL-1β預測預后良好組患者的AUC分別為0.884(95%CI：0.835～0.934)、0.880(95%CI：0.832～0.928)，NLRP3與IL-1β對患者的預后具有較高的預測價值，說明NLRP3與IL-1β參與了患者疾病預后進程。NLRP3胞內某些模式識別受體能夠感受到細胞外的危險信號，這有助于炎癥因子的成熟，從而參與人體免疫反應。NLRP3是目前研究較多的炎癥小體，其功能異常與許多先天、后天免疫性疾病有關。本研究結果顯示，NLRP3與IL-1β參與葡萄膜炎患者的疾病進程及預后，且二者與疾病嚴重程度也具有關系，可能是NLRP3與IL-1β之間相互影響所致。NLRP3可識別各種外源性、內源性炎癥信號，通過不同的識別受體，促進炎癥因子的生成，并產生炎癥免疫反應；IL-1β是白細胞介素家族中的重要組成因子，主要由單核巨噬細胞合成與分泌，當NLRP3被活化后，將前體形式的IL-1β剪切成為成熟具有活性的炎癥因子，從而參與到人體疾病的進展與發展中[18]。

綜上所述，NLRP3作為固有免疫系統的重要組成部分，其參與了葡萄膜炎疾病的發生、發展及預后進程。NLRP3被活化后可激活下游IL-1β炎癥因子的分泌，共同參與葡萄膜炎疾病發展。但NLRP3在葡萄膜炎患者中的具體作用機制仍需進一步明確，以期為臨床中葡萄膜炎患者的治療提供全新靶點。