長鏈非編碼RNA Lnc00478在卵巢癌組織及細胞系中的表達及臨床意義

胡玉利

東部戰區總醫院婦產科，江蘇南京 210002

卵巢癌是女性個體中發病率和病死率都較高的生殖系統惡性腫瘤[1]，由于早期缺乏特異的癥狀和篩查手段，卵巢癌確診時一般已經發展至晚期，同時還對化療藥物耐藥導致復發率高達70%，是卵巢癌難以治愈的主要原因[2]。盡管目前外科手術聯合傳統的化療在卵巢癌治療上取得很大的進展，但由于卵巢癌易廣泛轉移，絕大部分晚期患者在5年內復發[3]。雖然很多生物標志物已經確認為卵巢癌重要的預測因子[4-5]，卻很少能作為獨立的預測因子，因此開發卵巢癌早期的生物標志物，將為卵巢癌的早期診斷和治療提供幫助。

長鏈非編碼RNA(LncRNA)是不具有蛋白編碼功能且長度多于200個核苷酸的RNA，既往研究表明LncRNA在腫瘤的多種生物學行為中發揮重要的調控作用，如腫瘤發生、轉移等[6-8]。長鏈非編碼RNA Lnc00478尚未明確在卵巢癌中的臨床價值，本研究應用實時熒光定量PCR(qPCR)技術分析Lnc00478在卵巢癌中的表達情況，結合RNA干擾技術和功能試驗探討Lnc00478在卵巢癌組織和細胞株中扮演的角色。

1 材料與方法

1.1標本來源 收集東部戰區總醫院婦產科2018-2019年行手術治療的卵巢癌患者病歷資料。入組標準：(1)標本均病理診斷為卵巢癌，且癌旁組織未檢測到腫瘤細胞；(2)術前未接受激素治療及放化療；(3)患者均系首次診斷、首次治療，未合并其他疾病或其他腫瘤。滿足上述條件的病例共計80例，年齡30～75歲，標本獲取后根據病理結果分為癌組織、癌旁組織(距腫瘤0.5 cm)。本研究經醫院倫理委員會批準，患者均知情同意。

1.2細胞來源 人高轉移卵巢癌細胞(HO-8910PM細胞)購于中國上海中科院生物研究所。HO-8910PM細胞是一株來源于人卵巢癌細胞(HO-8910)的高轉移亞系。

1.3試劑與儀器 Trizol試劑盒和LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司，反轉錄試劑盒購自日本Takara公司，SYBR Green PCR試劑盒購自美國Thermo Fisher公司，7900型qPCR儀購自美國ABI公司，2510E-MTH型超聲震蕩儀購自美國Branson Ultrasonics公司，Tanon-5200化學放光成像系統源自上海天能科技公司。

1.4方法

1.4.1RNA的提取及qPCR 采用Trizol試劑提取卵巢癌組織、癌旁組織和卵巢癌細胞株中的RNA，測得RNA水平后反轉錄成cDNA。qPCR反應按照SYBR Green PCR Master Mix試劑盒說明書在qPCR儀上進行。Ct值的獲取主要借助于RQmanager軟件，分別統計96孔板各孔的Ct值，取腫瘤組織、癌旁組織及內參β-Actin的平均Ct值，采用2-ΔΔCt方法計算：即ΔΔCt=(Ct腫瘤組織-Ctβ-Actin)-(Ct癌旁組織-Ctβ-Actin)，ΔΔCt值為負數提示Lnc00478在腫瘤組織表達高于癌旁組織，并且數值越大，表示Lnc00478在卵巢癌的腫瘤組織中的表達越高。相應引物序列如下：Lnc00478，正向引物5′-TTACAGCGTCTCTGGTCGTG-3′；反向引物5′-CCAATTGTTCTGGGCTGCAC-3′。甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)，正向引物5′-CCACTGGCATCGTGATGGA-3′；反向引物5′-CCAATTGTTCTGGGCTGCAC-3′。

1.4.2細胞培養 HO-8910PM細胞株在含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素的RPMI 1640培養基，37 ℃、5%CO2濕潤條件下培養，每3天傳代1次。

1.4.3小干擾RNA(siRNA)轉染 將HO-8910PM細胞接種到6孔板中,待細胞長到80%交融后，采用LipofectamineTM2000進行Lnc00478 siRNA轉染，同時設置對照組并用PCR技術檢測siRNA的轉染效率。Lnc00478 siRNA和siRNA對照序列如下：siRNA-1，5′-ACTTGTATTCTGGGCTGCAC-3′。siRNA-2，5′-CTGCACGTTCTGGGCTGCAC-3′。siRNA-NC，5′-TGCACTGTTCTGGGCTGCAC-3′。

1.4.4克隆形成實驗 HO-8910PM細胞分別用Lnc00478 siRNA(siRNA-1和siRNA-2)轉染，種于12孔板并置于37 ℃、5%CO2培養箱中培養，在培養后的第10天，用75%乙醇固定細胞30 min,0.1%結晶紫溶液對細胞染色30 min,顯微鏡下計數。

1.4.5細胞遷移和侵襲實驗 用75%乙醇溶液固定穿出小室膜部的HO-8910PM細胞，20 min后,將上層的小室放置于0.1%結晶紫染液中，對穿過膜部的細胞染色30 min。染色過后用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗2遍，將小室放置在光學顯微鏡下觀察，選取多個角度進行拍照。

2 結 果

2.1Lnc00478在卵巢癌組織和癌旁組織中的表達比較 qPCR結果表明卵巢癌組織中Lnc00478高表達和低表達例數分別為59例和21例，與癌旁組織中28例高表達和52例低表達相比，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 卵巢癌組織和癌旁組織中Lnc00478的表達情況(n)

2.2Lnc00478與臨床病理特征的關系 Lnc00478的表達水平與腫瘤大小、發病年齡、淋巴結轉移、TNM分期等多種因素有關，腫瘤最大徑≥2 cm、年齡≥50歲、有淋巴結轉移及TNM分期Ⅲ～Ⅳ期的卵巢癌患者Lnc00478表達水平更高(P<0.05)。Lnc00478與有無卵巢癌家族史無關(P>0.05)，見表2。

表2 Lnc00478的表達水平與患者臨床病理特征的關系(n)

2.3siRNA干擾Lnc00478的表達水平對HO-8910PM細胞增殖的影響 PCR結果提示，siRNA-1、siRNA-2敲低Lnc00478后HO-8910PM細胞的增殖分別下調了(71±6)%、(50±7)%，siRNA-1的干擾效率優于siRNA-2，差異有統計學意義(P<0.05)，故采用siRNA-1來干擾Lnc00478的表達，克隆形成實驗結果顯示，Lnc00478干擾后，siRNA-1干擾的HO-8910PM細胞數量為(122±16)個，siRNA-NC干擾的HO-8910PM細胞數量為(321±27)個，HO-8910PM細胞克隆形成能力降低，差異有統計學意義(P<0.01)。

2.4Lnc00478干擾對HO-8910PM細胞的遷移和侵襲能力的影響 細胞遷移實驗結果顯示，Lnc00478干擾后穿出小室膜部的HO-8910PM細胞數量為(95±8)個，少于對照組的(142±11)個，差異有統計學意義(P<0.05)。細胞侵襲實驗結果顯示，Lnc00478干擾后侵襲的HO-8910PM細胞數量為(56±8)個，少于對照組的(98±4)個，差異有統計學意義(P<0.01)。

3 討 論

LncRNA屬于非編碼RNA，但對基因的表達發揮著重要的調控作用。目前研究表明LncRNA不僅是細胞生理水平的重要調節因子，還可通過免疫應答、表觀遺傳、基因降解等途徑調控腫瘤細胞的生物學行為[9-10]。目前，腫瘤相關性LncRNA的功能已經被逐漸整理歸類，腫瘤特異性LncRNA調節異?？赡茏鳛樾碌念A測性生物標志物，從而對腫瘤進行早期的診斷及腫瘤的發展和預后進行評估[11]。LncRNA被證實與多種腫瘤密切相關，調控著腫瘤細胞的增殖、侵襲、遷移能力[12]，趙清等[13]的研究表明LncRNA的異常表達與鉑類、紫杉醇耐藥有關，降低卵巢癌患者病死率的關鍵是早期診斷和治療，以及對化療耐藥的有效預測。LncRNA為藥物設計、治療和耐藥性評估提供新的研究靶點。林麗等[14]研究表明LncRNA MCM3AP-AS1可通過靶向抑制miR-876-5p促進卵巢癌細胞的增殖、遷移和侵襲。李晗宇等[15]研究表明LncRNA DRAIC調控miR-181，通過STAT信號通路對卵巢癌遷移和侵襲帶來影響。沈芳芳等[16]研究表明LncRNA Lnc00261在卵巢癌患者癌組織中表達下調,其表達水平與卵巢癌患者的惡性程度有關,上調LncRNA Lnc00261表達可抑制卵巢癌細胞SKOV3的增殖、遷移和侵襲能力。

本研究發現，Lnc00478在卵巢癌組織中的表達水平高于癌旁組織，并且與卵巢癌的多種臨床病理特征相關。同時HO-8910PM細胞的體外功能實驗結果表明，Lnc00478能促進卵巢癌細胞的增殖和侵襲能力，但具體分子機制有待進一步研究，其可能成為卵巢癌早期診斷的潛在標志物和治療新靶點。