響應面法優化黑莓精粉超聲提取工藝及其抗氧化活性研究

唐瀟冉，周欣，龔小見，趙超

(貴州師范大學貴州省山地環境信息系統與生態環境保護重點實驗室，喀斯特山地生態環境保護與資源利用協同創新中心，貴州省藥物質量控制及評價技術工程實驗室，天然藥物質量控制研究中心，貴州 貴陽 550001)

黑莓(RubusfruticosusL.)為薔薇科懸鉤子屬多年生藤本植物，原產于北美，1986年由中國科學院植物研究所首次從美國引入[1].黑莓因富含大量天然活性物質，尤其是花青素，而備受消費者喜愛.花青素是自然界一類廣泛存在于植物中的水溶性天然色素[2]，具有抗炎[3]、保護心血管[4]、防衰老[5]、抗氧化[6]、抗腫瘤[7]等作用，被廣泛應用于食品、藥品、保健品、化妝品等行業.

現有研究較多的是黑莓籽油[8]、黑莓渣[9]和黑莓汁[10-11]以及顯著的生物活性等.Caillot等[12]研究發現黑莓酒中分離的多糖具有很好的抗炎作用；De Gomes等[13]研究發現黑莓汁花青素對順鉑誘導的小鼠腎損傷具有保護作用；Gowd等[14]研究發現黑莓經胃腸消化和腸道微生物發酵后抗氧化活性增強，并具有潛在的抗糖尿病活性；Tatar等[15]研究發現黑莓提取物能通過抑制人結直腸癌細胞端粒酶活性發揮抗癌作用.

黑莓具有諸多藥理活性，但由于黑莓鮮果不耐保存，目前的加工產品主要有黑莓酒、飲料、果醬和黑莓粉等.黑莓粉可以在保存天然風味物質的同時延長保存周期，是一種黑莓深加工利用的有效途徑，可添加在固體飲料、保健品、食用薄膜等產品中.Gislaine等[16]將黑莓粉添加在箭根淀粉的可食用薄膜中以改善薄膜的厚度、顏色、水溶性、透水性、花青素含量和抗氧化性能等理化性質；朱泓等[17]對黑莓凍干果粉進行研究發現其具有很好的抑菌抗炎活性；張麗霞等[18]以出粉率和含水量為指標通過噴霧干燥工藝制備黑莓粉，并進行了工藝參數優化.目前黑莓粉多采用對黑莓漿直接噴霧干燥制備，但該方法對產品的花青素等天然風味物質損失較大，對黑莓利用率不高[19-20].本研究以黑莓作為主要研究對象，應用真空冷凍干燥技術制備黑莓精粉，并采用響應面法優化其超聲提取工藝，并對其體外抗氧能力進行測定，以期為黑莓的綜合利用提供科學依據.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑莓，產地為山東萊陽；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)，東京化成工業株式會社；矢車菊素-3-O-葡萄糖苷對照品，寶雞市辰光生物技術有限公司；2,2-聯氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)，笛醫生物科技有限公司；過硫酸鉀、抗壞血酸、甲醇、鹽酸、無水乙醇等均為分析純.

1.2 儀器與設備

Spectra Max Plus 384酶標儀，美國Molecular Device公司；R-200旋轉蒸發儀，瑞士BUCHI公司；FD-1D-80真空冷凍干燥機，北京博醫康實驗儀器有限公司；KQ-300DE數控超聲波清洗器，昆山超聲儀器有限公司.

1.3 試驗方法

1.3.1 黑莓精粉的提取工藝用料理機將黑莓打碎勻漿，準確稱取黑莓漿3.00 g于250 mL具塞錐形瓶中，按1∶25的料液比(g/mL)加入蒸餾水，超聲提取30 min，離心后過濾，取濾液經真空旋轉蒸發儀進行濃縮，濃縮液置于已干燥至恒質量的蒸發皿中，冷凍24 h后經真空冷凍干燥機干燥24 h，即得到黑莓精粉.

1.3.2 花青素含量的測定 以不同濃度的矢車菊素-3-O-葡萄糖苷做標準曲線進行分析測定[21].標準曲線方程為：Y=0.001 8X-0.001(R2=0.999 0，線性范圍43～430 μg/mL).同法測定黑莓精粉中花青素的含量，按照標準曲線計算質量濃度，按公式(1)計算.

(1)

式中：C為樣品溶液中花青素的質量濃度，μg/mL；V為溶液定容體積，mL；N為稀釋倍數；M為精粉稱取的質量，g.

1.3.3 精粉得率的計算 參考文獻[22]所描述的方法稍作修改計算精粉得率.將提取的濾液置于真空旋轉蒸發儀進行濃縮，濃縮液于已干燥至恒質量的蒸發皿中放入冰箱中，冷凍24 h后經真空冷凍干燥機進行干燥24 h，放置室溫后稱量，按照公式(2)計算.

(2)

式中：M為黑莓漿的質量，g；M1為蒸發皿的質量，g；M2為蒸發皿和精粉干燥后的總質量，g.

1.3.4 單因素試驗參考文獻方法[2,23]，在超聲時間30 min，超聲功率120 W，料液比(g/mL) 1∶25的基礎條件下，保持其他因素不變，只改變其中一個因素，設置料液比( g/mL) 1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30，提取時間10、20、30、40、50 min，超聲功率120、180、240、300 W，以黑莓精粉得率及花青素含量為指標，每組試驗重復3次進行單因素試驗.

1.3.5 響應面試驗設計 在單因素試驗結果的基礎上，Box-Behnken試驗選取提取時間(A)、提取功率(B)和料液比(C) 3個自變量，以精粉得率和花青素含量的總評歸一值(OD)為評價指標，設計三因素三水平響應面試驗.試驗的因素與水平見表1.

表1 響應面試驗設計因素水平表Table 1 Variables and levels in the response surface methodology

根據Hassan[24]的方法對精粉得率和花青素含量兩個指標進行歸一化計算，見公式(3).

di=(Yi-Ymin)/(Ymax-Ymin)

(3)

式中：Yi為實測值，Ymax和Ymin為各指標在不同組試驗中檢測所得的最大值和最小值.根據上述公式計算出各指標的di值后，計算總評歸一值OD=(d1×d2×…×dk)1/k，k為指標數.

1.3.6 體外抗氧化活性檢測

1.3.6.1 DPPH自由基清除能力的測定 參照文獻[25-26]的方法略作修改，具體為：準確稱取9.87 mg DPPH，用無水乙醇溶解，定容至100 mL，得到0.25 mmol/L溶液.取0.5 mL不同濃度的黑莓精粉溶液和抗壞血酸對照品溶液分別與0.5 mL濃度為0.25 mmol/L DPPH乙醇溶液混合，搖勻，室溫下避光反應30 min，測定其在517 nm處的吸光值(Ai)，各平行測定3次.以等體積無水乙醇代替DPPH乙醇溶液為對照(Aj)，等體積蒸餾水代替樣品溶液為空白(A0)，將測得數據帶入下列公式(4)計算DPPH自由基清除率：

(4)

1.3.6.2 ABTS自由基清除能力的測定 參照文獻[27-28]的方法略作修改，具體操作為：準確稱取77.03 mg ABTS和13.40 mg過硫酸鉀，分別用蒸餾水溶解，定容至10 mL，兩種溶液按1∶1比例混合后室溫下避光反應12～16 h，得到 ABTS自由基儲備液.使用前稀釋儲備液，使其在734 nm處吸光度為0.70±0.02.取0.4 mL不同濃度的樣品溶液和抗壞血酸對照品溶液分別與0.8 mL ABTS自由基溶液混合，搖勻，室溫下避光反應20 min，測定其在734 nm處吸光值(Ai)，各平行測定3次；以等體積水代替ABTS溶液為對照(Aj)測定吸光度，以等體積蒸餾水代替樣品溶液為空白(A0)測定吸光度，將測得數據帶入公式(5)計算ABTS自由基清除率：

(5)

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果及分析

2.1.1 料液比對黑莓精粉得率和花青素含量的影響 由圖1可知，隨著料液比的增加，黑莓精粉的得率和花青素含量顯著升高(P<0.05)，料液比(g/mL)為1∶25時，精粉得率和花青素含量達到最高；當料液比高于1∶25 (g/mL)時，精粉得率和花青素含量均略有降低，但無顯著性差異(P>0.05).可能是因為料液比增加時增大了溶劑和黑莓中花青素質量濃度差異，傳質推動力大，有助于花青素的溶出[29]，促進精粉的提取；但花青素在一定量溶劑下已經全部溶解，繼續增加溶劑體積不再促進花青素的溶出，反而可能促進雜質的溶出，降低花青素含量[23].因此，選擇1∶25作為提取的最佳料液比.

小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05).Different letters indicate the significant differences(P<0.05).圖1 料液比對精粉得率和花青素含量的影響Figure 1 Effects of solid-to-liquid ratios on powder yield and anthocyanin content

2.1.2 超聲時間對黑莓精粉得率和花青素含量的影響 如圖2所示，隨著超聲時間的增加，黑莓精粉得率和花青素含量逐漸增加(P<0.05)，超聲時間為30 min時，精粉得率和花青素含量達到最高，大于30 min后精粉得率和花青素含量逐漸下降.可能原因是適當增加提取時間有助于細胞充分破碎，促進黑莓花青素的溶解，但超聲時間增長使溶液溫度升高，會使熱敏性的花青素變性、分解[29-30]，降低花青素質量濃度，精粉得率也隨之降低，但變化不顯著(P>0.05).因此，選取30 min為最佳超聲時間.

小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05).Different letters indicate the significant differences(P<0.05).圖2 超聲時間對精粉得率和花青素含量的影響Figure 2 Effects of ultrasonic time on powder yield and anthocyanin content

2.1.3 超聲功率對黑莓精粉得率和花青素含量的影響 如圖3所示，隨著超聲功率的逐漸增加，精粉得率和花青素含量呈先增后降的趨勢，超聲功率為180 W時精粉得率和花青素含量最高.可能是由于隨著超聲功率增加，超聲波的機械作用和空化效應能力增加，造成黑莓細胞壁破壞，促進了精粉提取和花青素溶解；但當功率大于180 W時，高強度的空化作用破壞花青素結構，使花青素含量減少，降低精粉得率[31]，不利于黑莓精粉的提取，因此選擇180 W為最佳提取功率.

小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05).Different letters indicate the significant differences(P<0.05).圖3 超聲功率對精粉得率和花青素含量的影響Figure 3 Effects of ultrasonic power on powder yield and anthocyanin content

2.2 響應面試驗結果及分析

在單因素試驗結果的基礎上，根據Box-Behnken設計原理，以超聲時間(A)、超聲功率(B)和料液比(C)3個因素作為自變量，以精粉得率和花青素含量的總評歸一值(OD)為響應值，采用響應面法進行三因素三水平的響應面分析，研究各因素對提取黑莓精粉影響的顯著性和各因素的最佳組合，試驗設計方案及結果見表2.

2.2.1 方差分析及回歸模型的擬合分析 結合表2結果，利用Design-Expert 8.0.6軟件對試驗數據進行處理，得到OD值與單因素超聲時間(A)、超聲功率(B)和料液比(C)的二次方程模型.

表2 Box-Behnken 試驗設計及結果Table 2 Box-Behnken design and experimental results

OD=0.81+0.045A-0.12B+0.17C+0.012AB-0.023AC-0.12BC-0.033A2-0.30B2-0.25C2

從表3可以看出，該回歸方程的一次項B、C差異顯著，且C為極顯著，表明料液比(C)的影響較大；交互項差異不顯著，二次項B2、C2差異極顯著.在所選取的各因素水平范圍內，A、B、C這三因素對黑莓精粉提取的影響順序為：C>B>A，即料液比>超聲功率>超聲時間.

表3 響應面二次回歸模型方差分析結果Table 3 Result of ANOVA for response surface quadratic regression model

2.2.2 響應面分析 各因素交互作用對黑莓精粉得率和花青素含量影響的響應曲面圖如圖4所示.響應面坡度平緩說明因素間的交互作用較弱，即試驗條件的改變對響應值影響不大；反之則表明因素間的交互作用強，對響應值影響大.等高線圖呈橢圓形表明因素的交互作用，而圓形則相反，表明兩因素的交互作用對響應值影響不大[31].結合表3中數據可知，超聲時間、料液比對OD值均有顯著影響.各因素對響應值的顯著性表現為：料液比>超聲功率>超聲時間.圖4中響應面坡度都比較平緩，說明其超聲時間、超聲功率和料液比之間的交互作用對OD值的影響不顯著.

圖4 各因素交互作用的響應面Figure 4 Response surface diagrams of interaction of various factors

2.2.3 確定最佳工藝參數與模型驗證 通過響應面回歸模型分析得到黑莓精粉的最佳提取工藝條件為：提取時間30.79 min，提取功率164.49 W，料液比(g/mL)1∶27.02，OD的理論預測值為0.859 2.考慮操作的可行性，對上述工藝條件進行修正，最佳條件為：提取時間30 min、提取功率180 W、料液比(g/mL)1∶27.在此修正條件下進行試驗驗證，結果顯示：精粉得率為(9.22±0.07)%，花青素含量為(11.21±0.32)mg/g，OD值為0.875 1，與理論預測值相近，表明利用響應面分析法得到的黑莓精粉提取工藝參數真實可靠，具有實用價值.

2.3 黑莓精粉體外抗氧化活性分析

2.3.1 黑莓精粉清除DPPH自由基的能力 由圖5可知，當樣品質量濃度在0.01～0.60 mg/mL時，黑莓精粉對DPPH自由基具有較好的清除能力，且與其質量濃度呈顯著的量效關系，當質量濃度為0.60 mg/mL時，清除率達到(92.56±0.12)%.在試驗設計質量濃度范圍內，黑莓精粉對DPPH自由基的清除能力稍弱于抗壞血酸，IC50為(0.10±0.01)mg/mL.

圖5 黑莓精粉對DPPH自由基的清除能力Figure 5 DPPH free radical scavenging activity of blackberry powder and ascorbic acid

2.3.2 黑莓精粉清除ABTS自由基的能力 如圖6所示，當樣品質量濃度在0.02～0.60 mg/mL時，黑莓精粉對ABTS自由基的清除能力隨著質量濃度的增大而增加，存在顯著的量效關系，當質量濃度為0.60 mg/mL時，清除率達到(75.86±0.28)%.黑莓精粉對ABTS自由基清除率的IC50為(0.19±0.05) mg/mL，清除能力弱于抗壞血酸.

圖6 黑莓精粉對ABTS自由基的清除能力Figure 6 ABTS free radical scavenging activity of blackberry powder and ascorbic acid

3 討論

超聲提取是提取植物花青素的常用方法，具有花青素得率高、操作簡便、耗時短等優點[32].果粉的干燥方式主要有真空冷凍干燥、噴霧干燥、熱風干燥、遠紅外干燥等.不同干燥方式對藍莓[33]、桑葚[34]、櫻桃[35]果粉影響的研究結果表明，真空冷凍干燥能較好地保留果粉中花青素等天然活性成分，果粉品質高.黑莓屬于熱敏性物料，加熱時會造成天然活性成分損失，因此本研究采用真空冷凍干燥方式制備黑莓精粉.

本試驗考察了超聲功率、超聲時間和料液比對黑莓精粉中花青素含量和精粉得率的影響，在此基礎上利用響應面試驗優化黑莓精粉提取工藝，建立的回歸模型和現實擬合度較高，表明方法穩定可靠.徐懷德等[36]通過響應面試驗得出各因素對原花青素得率的影響順序為料液比>超聲功率>超聲時間，與本試驗結果相吻合.響應面優化后最佳工藝條件下精粉得率為(9.22±0.07)%，花青素含量為(11.21±0.32)mg/g，而陳力宏等[37]采用正交試驗優化黑莓果花青素的提取工藝，黑莓花青素含量為0.303 mg/g，Braga等[38]采用噴霧干燥的方式制備的牛奶黑莓粉，花青素含量為(568.6±3.4)μg/g，均低于本研究中黑莓精粉的花青素含量.

黑莓花青素具有抗氧化活性，黑莓產品也具有良好的清除氧自由基的能力，尹震花等[8]研究黑莓籽油的化學成分發現黑莓籽油具有清除ABTS自由基(IC50為214.64 mg/L)和還原鐵離子(Trolox當量(22.53±2.92)μmol/g)的能力.汪洪濤等[10]采用響應面法優化了黑莓渣中抗氧化物質提取工藝，結果顯示，得出最優條件下提取液的抗氧化能力為15 228.8 unit/g.本研究制得的黑莓精粉對DPPH和ABTS自由基均具有較好的清除能力，且在一定范圍內，清除能力隨質量濃度增加而增加，其IC50分別為(0.10±0.01)mg/mL和(0.19±0.05)mg/mL.

4 結論

本研究得到的黑莓精粉最佳粗提條件為：超聲時間30 min、超聲功率180 W、料液比(g/mL)1∶27，在此工藝條件下，精粉得率為9.22%，花青素含量為11.21 mg/g.與理論預測值相近，表明利用響應面法優化黑莓精粉超聲提取工藝條件切實可行，操作簡單便捷，精粉得率和花青素含量高，具有實用價值.黑莓精粉對DPPH自由基和ABTS自由基清除的IC50值分別為0.10 mg/mL和0.19 mg/mL，具有一定的抗氧化能力，可以作為一種天然抗氧化劑開發，在功能食品和藥品方面具有較好的開發前景.