小麥-簇毛麥易位系V832抗條銹性遺傳分析及細胞學鑒定

盧濤,楊艷,徐志,馬東方,,尹軍良

( 1.長江大學農學院，主要糧食作物產業化湖北省協同創新中心,湖北 荊州 434025;2.四川省農業科學院植物保護研究所，農業部西南作物有害生物綜合治理重點實驗室,四川 成都 610066)

由小麥條銹菌(Pucciniastriiformisf.sp.tritici) 引起的小麥條銹病在我國西北麥區、長江中下游麥區、華北麥區、西南麥區等地普遍發生，尤其是西北地區的小麥條銹病最重[1-2].雖然化學藥劑防治可以及時控制該病害，但是有違我國目前提倡的“減藥”方針.而且小麥條銹菌極易通過有性生殖產生新的毒性更強的生理小種，加之大面積推廣小麥品種的抗感病程度不同或抗源的單一化導致條銹病常年大范圍發生和大區域流行[3-4]，已嚴重影響我國糧食安全.

截至2019年，國際上正式命名的抗條銹基因已有81個，即Yr1～Yr81[5-6].其中Yr5、Yr8、Yr9、Yr15、Yr17、Yr19、Yr24、Yr26、Yr28、Yr35、Yr36、Yr37、Yr38、Yr40、Yr42來自于小麥的稀有種或近緣種屬，其余抗條銹病基因均來自普通小麥.除了上述已經命名的基因以外，還有一些未被正式命名的基因.如本課題組暫命名的抗條銹病基因YrR39、YrBai、YrH9017、YrH9015、YrS1和YrS2等[7-10].聚合全生育期和成株期抗條銹基因的小麥可達到持久抗條銹的特點[11].自1950年以來，我國已經發生了7次大規模小麥抗條銹“喪失”事件[12].因此，迫切需要鑒定新的抗條銹小麥品種(系)，加速持久抗病小麥的選育.

小麥野生近緣植物中含有豐富的優良抗逆基因，利用遠緣雜交技術將外緣抗病基因導入普通小麥，對改良普通小麥的抗性，累積抗病遺傳增益具有重要戰略意義[13-14].簇毛麥(Haynaldiavillosa2n=14VV)是小麥亞族簇毛麥屬的一年生二倍體物種，對小麥全蝕病、小麥條斑病和葉枯病等具有良好抗性.傅杰等[15]已成功將簇毛麥的這些優良基因導入普通小麥中，形成一系列的小麥新品系.本研究利用我國流行的條銹菌小種(菌系)對簇毛麥易位系V832進行抗性鑒定、遺傳分析和細胞學分析，以明確V832是否攜帶小麥抗條銹病基因并鑒定抗病基因來源以及細胞學特性，為進一步利用簇毛麥中優良抗條銹病基因提供理論支持.

1 材料與方法

1.1 供試材料

小麥V832、銘賢 169、簇毛麥、普通小麥7182，由西北農林科技大學植物保護學院抗病遺傳研究室提供.以銘賢169為母本，與V832進行雜交獲得F1、F2、F3、BC1群體，條銹菌流行小種和菌系Su11-4、Su11-7、CYR23、CYR29、CYR32、CYR33及CYR34，由長江大學農學院分子真菌與基因組學實驗室保存.

1.2 試驗方法

所有供試小麥種子先用1%的H2O2浸泡10 min，蒸餾水清洗后浸種24 h，待種子萌發后播種，置于數控溫室中培育.待小麥幼苗長至二葉期接種第一片葉，用手指蘸清水輕搓葉片表面以脫去蠟質層，將新鮮條銹菌夏孢子涂抹于小麥葉片正面，接種后將小麥放入暗箱(10 ℃、相對濕度100%)培養，24 h后取出，放置溫室繼續培養，溫度控制在15～17 ℃(晝)/10～12 ℃(夜)，每日光照15 h，光照強度 729 mol/(m2·s)，相對濕度75%～80%[16].

1.3 調查與統計分析

待感病的銘賢169充分發病時調查接種小麥的發病程度.反應型分為11級，分別是：0、0;、0;+、1、1+、2、2+、3-、3、3+、4，發病程度從低到高劃分，其中0為免疫，4為小麥葉片著生大量條銹菌夏孢子堆且無褪綠斑，劃分0～2+型為抗病，3-～4為感病.據此標準調查抗病親本、感病親本、F1、BC1、F2和F2∶3代接種后的反應型[17].統計抗病和感病數目，計算雜交群體F2的抗感分離比例以及F2∶3家系的分離比例，并用χ2(≤χ20.05)和P值進行分離比例的適合度檢驗，確定最適分離比率，進而明確小麥V832含有的抗病基因數目[18].

1.4 基因組原位雜交(GISH)

將小麥V832種子放置在無菌水中培養，剪取1.5 cm新鮮根尖，放置于冰水中12 h，再固定于卡諾氏固定液(無水乙醇∶冰醋酸=3∶1)中24 h，蒸餾水清洗3遍后在45%冰醋酸中壓片，液氮冷凍揭片后置于-20 ℃保存.用地高辛(Roche,Germany)標記華山新麥草總DNA，與制備好的H1684雜交后加抗體地高辛-熒光素，用含適量碘化丙錠的抗褪色劑封片，最后置于熒光顯微鏡觀察染色體構型并照相[19].

2 結果與分析

2.1 V832苗期的抗性鑒定及抗性來源分析

以銘賢169為感病對照，用條銹菌生理小種Su11-4、Su11-7、CYR23、CYR29、CYR32、CYR33及CYR34對V832進行苗期抗條銹性接種測試.結果表明，V832對所有參與測試小種表現為免疫到高抗(表1).因此，V832是一個優良抗小麥條銹病的抗源.

用Su11-4、Su11-7、CYR23、CYR29、CYR32、CYR33及CYR34對簇毛麥和7182進行了苗期抗條銹性接種測試.結果顯示，V832的抗病反應型小麥與簇毛麥極為接近，為免疫到高抗( IT 0～0;)；而7182與銘賢169一致( IT 3+～4)(表1).據此推斷，V832對條銹病的抗性極有可能來自于簇毛麥.

表1 V832及其親本苗期的抗條銹性鑒定結果Table 1 Evaluation of resistance of V832 and its parents to Puccinia striiformis in seedling stage

2.2 V832 苗期抗病性遺傳分析

結果顯示，所有雜交群體的F1代均表現抗病反應型.接種Su11-7的BC1代群體中，12株抗病，14株感病，符合1∶1分離比(χ2=0.04，P=0.69)；F2群體中，102株抗病，31株感病，符合3∶1的分離比(χ2=0.12，P=0.65)；由F2獲得的F2∶3代家系中純抗家系36個，抗感分離家系66個，感病家系31個，符合1∶2∶1分離比(χ2=0.38，P=0.83).結果表明，V832對Su11-7的抗病性是由1對顯性基因控制.

接種CYR32的BC1代群體中，14株抗病，11株感病，符合1∶1分離比(χ2=0.16，P=0.55)；F2群體中，168株抗病，52株感病，符合3∶1的分離比(χ2=0.15，P=0.64)；F2∶3代家系中純抗家系61個，抗感分離家系105個，感病家系50個，符合1∶2∶1分離比(χ2=1.29，P=0.83).結果表明，V832對CYR32的抗病性是由1對顯性基因控制.

表2 V832對Su11-7和CYR32的抗條銹病遺傳分析Table 2 Inheritance analysis of V832 to Pst races of Su11-7 and CYR32

2.3 V832的細胞學特征

以簇毛麥總DNA為探針，對V832 進行了基因組原位雜交(GISH)試驗.結果表明，V832含有42條染色體，并有一對染色體片段呈現簇毛麥DNA信號(圖1).這表明V832含有來自簇毛麥的染色體或大的染色體片段.

圖1 V832的原位雜交結果Figure 1 Insitu hybridization analysis of line V832

3 討論

根據課題組多年田間鑒定結果，易位系V832具有良好的全生育期抗病性.本研究對V832的抗條銹性鑒定結果表明，V832對我國目前流行的條銹菌小種具有優良的抗病性，推測抗病基因可能來源于簇毛麥.V832對Su11-7和CYR32的抗、感病的分離比例符合3∶1的分離模式，說明衍生于簇毛麥的小麥新抗源V832對Su11-7和CYR32分別由一對顯性基因控制.但是V832對Su11-7和CYR32的抗病基因是否相同，以及該基因在V832染色體上的具體位置有待通過分子標記進一步確定.以便后續挖掘與抗病基因連鎖的分子標記用于分子輔助育種.

上世紀70年代中期起，南京農業大學細胞遺傳實驗室將簇毛麥的多種抗病基因導入普通小麥.研究者選育了一批兼抗白粉病和條銹病的小麥-簇毛麥異附加系、代換系和易位系[20].90年代末井金學等[21]用當時的小麥條銹病菌優勢小種CYR29、CYR30和CYR31測定了簇毛麥與小麥的雜交后代的抗條銹性，結果表明簇毛麥含有寶貴的抗條銹基因，并認為簇毛麥的抗條銹基因可轉移至普通小麥中，并且此類基因具有較強的傳遞性.進入21世紀以來，侯璐等[22]對兩個小麥-簇毛麥易位系進行抗條銹性遺傳檢測，表明小簇麥易位系V9128-1至少含有兩對抗條銹基因，V9129-1中至少含有3對抗條銹病基因.尹軍良等[23]對小麥-簇毛麥易位系中的V9125-3和V9125-4進行抗條銹性遺傳分析，表明V9125-3和V9125-4都至少含有兩對抗條銹基因.這5個易位系(V832、V9128-1、V9129-1、V9125-3和V9125-4)抗條銹基因的異同必須通過等位性分析加以確認.本實驗室后續將開展相關工作，以便于抗條銹基因的精準利用.周新力等[24]通過對小麥-簇毛麥易位系V9128-1進行抗條銹遺傳分析和分子標記，表明V9128-1對CYR30的抗條銹性是由一對顯性基因控制，并將YrV1定位于3BS染色體上.侯璐等[25]通過對小麥-簇毛麥易位系V9128-3進行抗條銹遺傳分析和分子標記，表明V9128-3對Su11-4的抗條銹性是由一對顯性基因控制，并將YrHV定位于2AL染色體上.王睿等[26]通過對小麥-簇毛麥易位系V9125-2進行抗條銹遺傳分析和分子標記，表明V9125-2對CYR29的抗條銹性是由一對顯性基因控制，并將YrWV定位于7DS染色體上，而且抗病基因YrWV不同于YrHV和YrV1.綜上，已育成的小麥-簇毛麥易位系中含有豐富的抗條銹基因，且為質量遺傳，作為抗源在小麥抗銹育種中具有重要的應用價值.利用外源抗病基因防治條銹病在我國小麥生產中也取得了良好的實踐效果，如小偃6號[27]、中梁22[28]等.本研究發現的優異抗病資源V832對多個條銹菌小種均具有良好抗病性，可能含有多個抗病基因，因此具有很好的利用價值.

4 結論

本研究通過基因組原位雜交(GISH)證實了V832含有來自簇毛麥的染色體片段，而且外源染色體片段長達整個染色體短臂，推測V832中的抗條銹病基因來源于簇毛麥.小麥易位系V832可以通過雜交將優良基因導入其他主栽小麥品種中，加之V832與普通小麥7182的農藝性狀接近，所以V832在育種上的直接利用更具可行性.尤其是在新的條銹菌小種不斷出現的形勢下，綜合利用簇毛麥中的抗條銹病基因對我國小麥抗病育種具有重要意義.