利用CRISPR/Cas9系統構建SBNO2基因敲除細胞系及其功能研究

王妍鱈，任亭亭，孫躍峰，劉磊

(1.甘肅農業大學動物醫學院，甘肅 蘭州 730070；2.中國農業科學院蘭州獸醫研究所，家畜疫病病原生物學國家重點實驗室，甘肅 蘭州 730046)

草莓缺口同源物2(Strawberry Notch Homolog 2，SBNO2)在Notch信號通路及NF-κB通路過程中發揮重要功能[1-2].Notch基因編碼一類高度保守的細胞表面受體，調節多種生物的細胞發育過程.Notch信號影響多能干細胞的分化、細胞凋亡、細胞增殖及細胞邊界的形成等過程.研究表明，IL-10以STAT3依賴的方式刺激SBNO2基因在骨髓巨噬細胞中的表達，SBNO2是IL-10下游抗炎作用通路上的重要組成部分，能夠抑制炎癥基因表達[3].在急性炎癥反應過程中，IL-6也能夠刺激乳鼠星形膠質細胞中SBNO2的表達[1].Karim等[3]發現SBNO2能夠顯著抑制NF-κB介導的轉錄并認為SBNO2可能與一系列其他蛋白相互作用，選擇性地抑制巨噬細胞中的轉錄.然而對于SBNO2基因在病毒感染過程中的作用機制研究很少，至今尚不清楚.

CRISPR/Cas9(clustered regularly interapaced short palin-dromic repeats/CRISPR-associated proteins 9)是一種由RNA核酸酶對目的基因進行特定DNA修飾的技術[4].RNA導向的CRISPR-Cas9系統已被應用于多種細胞系和生物體的DNA和RNA編輯[5-6].能夠快速且高效地進行表觀遺傳編輯，通過基因組位點敲除、修飾和突變，致使基因組表達受到調控，從而影響其功能[7].

口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)基因組編碼4種結構蛋白(VP1、VP2、 VP3和VP4)，其中VP1作為高度可變的結構蛋白，G-H環內有最具抗原性的位點[8-9].VP1編碼區的核苷酸序列因其在病毒附著、侵入、保護性免疫和血清型特異性等方面發揮重要作用，已被用于口蹄疫病毒毒株的遺傳特性鑒定以及分子流行病學研究[10-11].病毒基因組RNA進入衣殼形成病毒粒子前體，再通過RNA觸發VP0發生裂解反應，前病毒粒子最終被加工為成熟的病毒粒子，最終完整的病毒粒子從被感染的宿主細胞中釋放出來[9].本研究利用CRISPR/Cas9技術獲得SBNO2基因敲除的BHK-21細胞系，驗證該基因敲除后對口蹄疫病毒復制的影響，為進一步闡明SBNO2對口蹄疫病毒調控的作用機制奠定了基礎.通過深入探究FMDV感染的分子致病機制及其與宿主之間的相互作用，篩選出防控FMDV感染的新靶標，可以為新型疫苗的研發提供重要的理論依據.

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

乳倉鼠腎細胞(BHK-21)、O型口蹄疫病毒(FMDV/O/BY/2010)和pSpCas9-puro-2A質粒由家畜疫病病原生物學國家重點實驗室保存；大腸桿菌DH5α感受態購自Takara公司；SBNO2抗體購自Santa Cruz公司；DMEM 培養基、胎牛血清(FBS)、胰酶、嘌呤霉素均購自Gibco公司；轉染試劑Lipofectamine 2000和BCA蛋白定量分析試劑盒購自Thermo公司；限制性內切酶、T4 DNA連接酶購自NEB公司；質粒小量提取試劑盒、膠回收試劑盒、DNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；山羊抗兔二抗、山羊抗鼠二抗購自Sigma公司.

PCR儀(Bio-Rad，美國)；蛋白電泳裝置(Bio-Rad，美國)；電熱恒溫水浴鍋(DK-8D)型(上海精宏實驗設備有限公司，中國)；制冰機(Scotsman，美國)；立式壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫療器械廠，中國)；二氧化碳培養箱(Thermo，美國)；超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術有限公司，中國)；Nano Drop 2000超微量分光光度計(Thermo，美國)；MX3000P 實時定量PCR儀(Agilent Technologies，美國).

1.2 試驗方法

1.2.1 Western Blot方法檢測BHK-21細胞感染FMDV后SBNO2基因表達水平 取3 mL 1.0×105個/mL的BHK-21細胞懸液鋪在60 mm的培養皿中.待細胞生長匯合度達到80%時進行病毒感染，FMDV的TCID50為10-6.5/mL，按0.1 MOI的病毒量感染BHK-21細胞，分別于攻毒后的4、6 h收取細胞樣品.加入含1%蛋白酶抑制劑的蛋白裂解液裂解細胞，制備蛋白樣品.用BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測蛋白濃度，制備好的蛋白樣品進行Western Blot檢測.一抗4 ℃過夜孵育， HRP標記的二抗室溫孵育1 h.最后用ECL化學發光法進行顯影和曝光.

1.2.2 sgRNA設計及CRISPR/Cas9重組載體的構建 從NCBI中檢索倉鼠SBNO2基因序列(Gene ID:216161)，將序列輸入CRISPR在線設計軟件(http://tools.genome-engineering.org)中，設計了三組特異性sgRNA，如表1所示，送生工公司合成.

表1 靶向SBNO2基因的sgRNA序列Table 1 The sequence of sgRNA targeting SBNO2 gene

pSpCas9-puro-2A載體(Addgene公司)經BbsI酶切，放置55 ℃酶切1 h，酶切后回收線性載體.單鏈sgRNA序列退火后形成雙鏈DNA，反應體系為：正向和反向sgRNA(已稀釋至100 μmol/L)各1 μL，10×T4 Ligation Buffer 1 μL，T4 PNK 1 μL，ddH2O 6 μL,共10 μL.反應條件為37 ℃，30 min；95 ℃，5 min；之后以每分鐘降5 ℃從95 ℃降到25 ℃.利用T4連接酶將雙鏈DNA插入線性化的pSpCas9-puro-2A載體U6啟動子的下游，16 ℃反應3 h.之后加入ATP(10 mmol/L) 1.5 μL，ATP-dependent Plasmid Safe Exonuclease 1 μL，10 × Plasmid-Safe Buffer 1.5 μL；反應時間為37 ℃，30 min；70 ℃，30 min.最后將連接好的全部產物轉化至大腸桿菌感受態DH5α，培養后挑取單克隆菌落送生工測序.

1.2.3SBNO2基因敲除的細胞系制備及篩選 將BHK-21細胞鋪到6孔板中，待細胞生長匯合度達到80%時，將重組質粒轉染到細胞中，轉染48 h后，按照3 μg/mL加入嘌呤霉素進行篩選，經過幾輪篩選后，陰性細胞全部死亡，將狀態良好的細胞進行傳代，采用有限稀釋法對細胞按比例稀釋到100 mm培養皿中，將試驗組細胞進行單個消化，挑取單克隆細胞并擴大培養，傳代后凍存備用.

1.2.4 BHK-21-SBNO2細胞系中SBNO2基因敲除及蛋白表達檢測

1.2.4.1 測序驗證BHK-21-SBNO2細胞系 收取單克隆細胞株，按照基因組提取試劑盒中的操作步驟提取基因組，PCR擴增后送生工公司進行測序及序列比對，確定SBNO2基因敲除的位置.

1.2.4.2 Western Blot檢測細胞系中SBNO2的蛋白表達水平 收取BHK-21-Ctrl和BHK-21-SBNO2單克隆細胞系，采用Western Blot的方法對細胞中SBNO2的蛋白水平進行檢測，方法參考1.2.2.

1.2.5 敲除SBNO2基因對FMDV復制的影響 用0.1 MOI FMDV分別感染BHK-21-Ctrl和BHK-21-SBNO2單克隆細胞，感染后6 h收取細胞提取總RNA.采用qRT-PCR的方法檢測細胞中結構蛋白VP1的mRNA轉錄水平.首先將收取的細胞用TRIzol法提取細胞總RNA，然后用Takara公司的反轉錄試劑盒按照說明書將提取的RNA反轉錄為cDNA.以β-Actin作為內參基因(β-Actin-F:GCTGGCCGGGACCTGACAGACTACC；β-Actin-R:TCTCCAGGGAGGAAGAGGATGCGGC)，qRT-PCR檢測VP1的相對表達水平(VP1-F：GACAACACCACCAACCCA；VP1-R：CCTTCTGAGCCAGCACTT).反應體系為：cDNA 2 μL，上游引物(10 μmol/L)1 μL，下游引物(10 μmol/L)1 μL，SYBR Premix ExTaq10 μL，ddH2O 6 μL共20 μL.反應程序為：第一步：預變性95 ℃，30 s；第二步：變性95 ℃，5 s；退火/延伸60 ℃，30 s，擴增40個循環.按照2-ΔΔct法對定量結果進行統計分析.

1.3 數據分析

2 結果與分析

2.1 BHK-21細胞感染FMDV后SBNO2蛋白表達受到抑制

通過Western Blot方法檢測FMDV感染的BHK-21細胞中SBNO2蛋白表達水平，用ImageJ軟件對結果進行灰度掃描分析.如圖1-A和1-B所示，與不接毒的對照組相比，FMDV感染4 h和6 h后BHK-21細胞中SBNO2蛋白表達水平顯著下調，FMDV感染4 h時，與對照組相比，SBNO2表達水平下調了約1.3倍(P<0.05)；FMDV感染6 h時，與對照組相比，SBNO2表達量下調了約3.5倍(P<0.05).如圖1-C和1-D所示，隨著FMDV感染復數的增加，細胞中SBNO2的表達量顯著減少.與對照組相比，感染0.1 MOI FMDV時SBNO2表達水平下調了約3倍(P<0.05).

A圖為FMDV感染不同時間點時BHK-21細胞中SBNO2蛋白水平變化情況，其中“4 h”指FMDV持續感染4 h；“6 h”指FMDV持續感染6 h；“-”為不感染FMDV的對照組細胞；“+”代表感染FMDV組細胞.B圖為A圖的灰度掃描結果分析；C圖為不同感染復數(MOI)的FMDV感染在BHK-21細胞后，SBNO2的蛋白水平變化情況； D圖為C圖的灰度掃描結果分析.Figure A shows the changes of SBNO2 protein levels in BHK-21 cells at different time points of FMDV infection,in which "4 h" refers to 4 h of continuous FMDV infection;"6 h" refers to 6 h of continuous FMDV infection;"-" is the control cell that is not infected with FMDV;"+" represents infected cells in the FMDV group.Figure B analysis of gray scanning results of Figure A;Figure C shows the changes of SBNO2 protein levels after FMDV infection with different infection complex (MOI) in BHK-21 cells.Figure D shows the gray scanning results of Figure C.圖1 FMDV感染后BHK-21細胞中SBNO2蛋白表達水平和灰度值分析Figure 1 Analysis of SBNO2 protein expression level in BHK-21 cells after FMDV infection

2.2 BHK-21-SBNO2細胞系中SBNO2基因及其蛋白敲除結果

2.2.1 Western Blot驗證敲除細胞系中SBNO2的蛋白表達下調 收取7組不同的單克隆細胞系，通過Western Blot的方法對細胞中SBNO2的蛋白表達水平進行檢測.如圖2所示，與對照組相比，有兩組克隆細胞株中SBNO2蛋白表達顯著下調，其中SBNO2-B5中SBNO2蛋白表達量下調約4倍(P<0.05)；SBNO2-D2中SBNO2蛋白表達量下調約3.3倍(P<0.05).表明SBNO2-B5和SBNO2-D2兩組細胞系中SBNO2基因敲除效果明顯.

A圖和C圖分別為BHK-21細胞在敲除SBNO2后，SBNO2的蛋白表達水平變化；B圖為A圖的灰度掃描結果分析；D圖為C圖的灰度掃描結果分析.Figure A and Figure C show the changes of SBNO2 protein expression level in BHK-21 cells after SBNO2 knockout.Figure B shows the gray scanning results of Figure A;Figure D shows the gray scanning results of Figure C.圖2 敲除SBNO2蛋白的Western Blot鑒定結果和灰度值分析Figute 2 Identification of SBNO2 knockout efficiency by Western Blot

2.2.2 SBNO2-B5和SBNO2-D2兩組細胞系測序結果 如圖3所示，與對照組相比，SBNO2-B5和SBNO2-D2兩組細胞中SBNO2基因發生移碼突變，表明成功構建敲除SBNO2基因細胞系.

圖3 SBNO2-B5和SBNO2-D2兩株敲除細胞系中SBNO2基因測序鑒定Figure 3 Sequence identification of SBNO2 gene in SBNO2-B5 and SBNO2-D2 cell lines

2.3 敲除SBNO2基因對FMDV復制影響的檢測結果

選用SBNO2-B5和SBNO2-D2兩組SBNO2基因敲低的細胞系感染FMDV，通過qRT-PCR方法檢測FMDV結構蛋白VP1的mRNA表達水平變化.如圖4所示，與對照組相比，SBNO2-B5和SBNO2-D2兩組細胞在感染FMDV 6 h后，VP1的mRNA表達水平顯著上調，其中SBNO2-B5組上調了約3.2倍(P<0.05)，SBNO2-D2組上調了約3.4倍(P<0.05).以上結果表明，與對照相比，SBNO2基因敲除的細胞系中，病毒復制加快.

圖4 敲除SBNO2基因對FMDV復制影響的檢測結果Figure 4 The impact of SBNO2 gene knockout on the replication of FMDV

3 討論

CRISPR/Cas9系統介導的基因編輯技術能夠快速且高效地編輯各種生物體的基因組，已被廣泛用于特定基因組位點的功能域，以探索其發育機制和基因表達調控[12-13].本試驗利用CRISPR/Cas9技術針對SBNO2基因設計了3組不同sgRNA的序列，構建SBNO2基因敲除質粒，并且成功獲得BHK-21-SBNO2敲除細胞系.敲除的細胞系中SBNO2基因表達被顯著抑制，在FMDV感染后，與對照細胞系相比，FMDV結構蛋白VP1表達水平顯著上調，表明BHK-21細胞中SBNO2基因敲除能夠促進FMDV復制，具體機制還有待進一步研究.

SBNO2是抑制炎癥基因表達的IL-10調節通路的組成部分，主要受IL-10信號通路的調控，并參與NF-κB的抑制.通過對IL-10誘導的巨噬細胞中特異性基因表達的驗證，發現SBNO2在轉錄調控方面具有關鍵作用.研究發現，GP130細胞因子家族成員和促炎細胞因子IL-1β和TNFα也能顯著上調SBNO2mRNA的表達，證明SBNO2在星形膠質細胞以及CNS中的其他細胞中起急性炎癥反應基因的作用[1].在小鼠和人的星形膠質細胞中，IL-6以劑量和時間依賴性的方式顯著上調SBNO2基因表達[1].隨著病毒感染時間和病毒總量的增加，一些抗病毒基因會出現表達量降低的現象[15].本研究中FMDV感染BHK-21細胞后SBNO2表達水平隨著時間、劑量的增加顯著降低，說明FMDV能夠影響SBNO2基因的表達，提示SBNO2基因可能在FMDV復制過程中發揮重要作用.Kasmi等[3]發現在293T細胞中，SBNO2能夠顯著地影響NF-κB的轉錄.NF-κB是細胞內重要的核轉錄因子，在病毒感染后的天然免疫應答中起重要作用[16].NF-κB和IRF3作為IFN的轉錄調控因子，可以通過兩種不同的途徑影響IFN的表達[17]，從而影響宿主的天然免疫反應及抗病毒基因的表達.SBNO2可能作為天然免疫中的模式識別受體，介導NF-κB信號通路從而激活天然免疫應答機制，對病毒感染后的免疫調控具有重要意義.面對敲除細胞系在FMDV感染后，病毒復制明顯增多.我們推測在本研究中SBNO2對FMDV增殖的影響也可能是通過調控宿主中IFN的表達來實現的，但仍需要進行后續研究對這一假設進行驗證.天然免疫是宿主抗病毒感染的第一道防線[18]，而在天然免疫過程中干擾素(IFN)的產生對于機體抗病毒感染具有重要作用.由于口蹄疫滅活疫苗需要大約7 d的時間誘導機體產生免疫保護，那么在此期間通過抗病毒干預的方法，增強機體抗病毒免疫應答，能夠為機體提供早期保護、減少病毒復制從而控制口蹄疫的傳播[19-20].我們推測SBNO2能夠作為一種抗炎、抗病毒因子對天然免疫應答起到正反饋作用，能為疫苗接種或其他基于免疫的干預措施提供新的策略.

4 結論

本研究利用CRISPR/Cas9系統，成功構建了CRISPR/Cas9-SBNO2重組質粒，采用嘌呤霉素篩選分離出BHK-21-SBNO2穩定敲除細胞株，經過測序及Western Blot驗證，獲得了敲除SBNO2基因的BHK-21細胞系.FMDV感染BHK-21-SBNO2細胞系后，FMDV復制顯著增多，表明敲除SBNO2可促進FMDV復制，為后續研究SBON2對口蹄疫病毒復制的分子機制奠定了基礎.