復方中草藥制劑抑菌作用及其對湖羊部分細胞因子mRNA表達的影響

薛瑞林，高強，李守湖，柳紀省，馬友記,3

(1.甘肅農業大學動物科學技術學院，甘肅 蘭州 730070；2.蘭州威特森生物科技有限公司，甘肅 蘭州 730030；3.甘肅省肉羊繁育生物技術工程實驗室，甘肅 民勤 733300)

隨著我國養羊業逐步向集約化、規模化方向發展，養殖方式和養殖規模轉變，羊群運動量減少，加之飼養管理方面的不足，乳房炎已經成為影響養羊業發展的重要因素之一[1-2].目前，使用抗生素仍然是國內外防治乳房炎的主流方法，但不管是傳統的對抗法還是以MIC為基礎獲得最佳療效的順勢法，本質都是抗生素療法，難免產生耐藥性[3]，加之臨床上抗生素的不合理使用，甚至導致細菌產生多重耐藥性，在造成企業養殖成本大大增加的同時，乳中大量藥物殘留也時刻威脅人類的健康[4].因此，及時準確的掌握養殖場乳房炎病原菌的種類和耐藥性情況，并篩選有效治療乳房炎的藥物以代替抗生素進行臨床上乳房炎的治療是控制乳房炎的關鍵.

中草藥作為一種傳統的“天然藥材”，因其副作用小、無毒無殘留、不易產生耐藥性而成為近年來治療乳房炎的熱門選擇[5].研究發現，中藥可以促進畜禽正常免疫器官發育，增強和恢復免疫功能，促進淋巴細胞增殖，促進和調節細胞免疫和體液免疫，促進多種細胞分泌細胞因子，對動物機體有很好的免疫促進作用[6].本研究就使用復方中草藥制劑，通過體外抑菌實驗和藥物注射實驗，檢測該制劑對乳房炎3種病原菌的抑菌效果及其對湖羊體內IL-2、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IFN-γ和TNF-α等7種細胞因子mRNA表達量的影響，以期為該制劑在臨床上的應用提供試驗基礎，對臨床上減少抗生素的使用，促進畜牧業綠色無抗生產提供理論參考.

1 材料與方法

1.1 材料

菌株為本實驗室從患有臨床乳房炎湖羊乳樣中分離得到菌株；牛津杯(6×8×10 mm)，購自北京博納瑞生科技有限公司；復方中草藥制劑由蘭州威特森生物科技有限公司自主研發和提供；RNAprep pure Blood Kit試劑盒，購自北京天根生物生化科技公司；Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒，購自Promega公司；TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ試劑盒，均購自TaKaRa公司；Applied Biosystems Quant Studio 3實時熒光定量PCR儀購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；10只年齡、胎次、健康狀況相近的預產期湖羊由武威普康養殖有限公司提供.

1.2 方法

1.2.1 菌液和中草藥制劑的制備 取純化培養后的菌株劃線于普通肉湯培養基上，37 ℃溫箱培養12～16 h后，挑取單菌落接種于營養肉湯，37 ℃、200 r/min培養12 h，利用平板菌落計數法對3種菌進行計數，調整菌液的終濃度為106CFU/ mL，標記后備用.

復方中草藥制劑主要成分為白頭翁、板藍根、柴胡、丹參、黃芪、當歸.該藥品經離心、過濾和濃縮的預處理，使得生藥含量為1.0 g/mL.離心后，取上清液用試管二倍稀釋法稀釋至500、250、125、62.5、31.25、15.625 mg/mL等6個濃度梯度，121 ℃高壓滅菌，標記后4 ℃保存以進行體外抑菌試驗.

1.2.2 體外抑菌試驗 吸取0.1 mL制備好的菌懸液，滴入事先準備好的經過高壓滅菌的普通營養瓊脂平板內，使用涂布器涂勻.參照陳薇[7]的方法，放置牛津杯，再用滴管往牛津杯中按濃度由大到小依次加入0.2 mL制備好的不同濃度中草藥制，蓋上平皿蓋.然后將滴加藥液的平皿水平置于恒溫箱內，37 ℃恒溫培養18～24 h，使用游標卡尺測量抑菌圈直徑.結果判定標準：抑菌圈直徑小于10 mm為耐藥；10 mm～15 mm為中度敏感；大于15 mm為高度敏感[8].

1.2.3 最低抑菌濃度(MIC)的測定 復方中草藥制劑對3種乳房炎病原菌最小抑菌濃度(MIC)的測定參考柯文杰等[9]的方法進行：將已二倍稀釋的復方中草藥制劑按濃度梯度依次分裝至試管，每個試管2 mL.再往每個濃度梯度試管中分別加入100 μL菌液，每個樣品做3個重復.同時每個梯度組設1支不含復方中草藥制劑只含等量菌液的陽性對照管以及1支不含菌液只含復方中草藥制劑的陰性對照管.37 ℃恒溫培養16～18 h.肉眼觀察無細菌生長時的最低藥物濃度為該藥的MIC.

1.2.4 最小殺菌濃度(MBC)的測定 復方中草藥制劑對3種乳房炎病原菌最小殺菌濃度(MBC)的測定參考聶鱺蓉等[10]的方法進行：從每種細菌的MIC和高于MIC濃度的各試管中分別吸取100 μL培養物，接種于營養瓊脂培養基，37 ℃恒溫培養48 h，肉眼觀察無菌落生長的最低復方中草藥制劑濃度即為最小殺菌濃度.

1.2.5 藥物注射及血樣采集 將母羊隨機分為試驗組和對照組，每組5只.母羊分娩當天記為第0天，試驗期28 d.試驗組母羊分別在分娩后1、4、7 d按5 mL/只肌肉注射復方中草藥制劑，對照組母羊不作處理.隨機選取試驗組和對照組母羊各3只分別在用藥前和用藥結束后第1、3、7、14、21 d使用抗凝的采樣管頸部靜脈采集3 mL全血血樣，標記并冷凍保存.

1.2.6 血液中RNA的提取及cDNA的合成 按RNAprep pure Blood Kit試劑盒說明書步驟提取血樣中RNA，每個樣品重復提取3次，定量后按照Thermo ScientificTMRevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒說明書進行反轉錄.cDNA置于-20 ℃保存待用.

1.2.7 細胞因子mRNA相對表達量的測量 采用實時熒光定量PCR法檢測IL-2、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IFN-γ和TNF-α的mRNA相對表達量.按照TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ試劑盒說明書進行RT-PCR反應.以β-actin作為內參，用Ct(△△Ct)法來處理RT-PCR結果，計算結果用2-△△Ct表示.各細胞因子及β-actin的mRNA引物序列由Primer Premier 5.0設計并檢測，引物信息見表1.

表1 細胞因子及內參引物序列Table 1 Primer sequences of cytokines and internal reference genes

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 復方中草藥制劑藥敏試驗

使用不同濃度中草藥制劑進行抑菌試驗，每株菌同一藥物濃度做3次重復，用游標卡尺測量抑菌圈直徑，取平均值(表2).結果顯示，該中草藥制劑對于3種乳房炎病原菌均有較強的抑殺作用.當藥物濃度為1 g/mL時，3種病原菌抑菌圈均在20 mm以上，并且藥物濃度相同的情況下，金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑普遍大于其他2種細菌.

表2 復方中草藥制劑耐藥實驗結果及判定Table 2 Resistance test results and determination of compound Chinese herbal medicine preparations

2.2 最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)

復方中草藥制劑對腸球菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的體外抑菌試驗結果表明，該制劑對3種乳房炎病原菌的MIC依次分別為125、125、62.5 mg/mL，MBC分別為250、125、125 mg/mL.

2.3 細胞因子mRNA相對表達量

采用RT-PCR技術檢測得到湖羊外周血中細胞因子mRNA相對表達量，結果如圖1所示.與對照組相比，湖羊外周血中IL-2、IL-8、IL-10、IL-12和IFN-γ mRNA表達量在試驗期內均表現為上升趨勢.上述細胞因子中，除IFN-γ在第1 天表達量增加不顯著(P>0.05)，IL-2和IL-12在第21 天表達量增加不顯著(P>0.05)外，其余細胞因子mRNA表達量在試驗期內均顯著上升(P<0.05或P<0.01).而在整個試驗期內，IL-6和TNF-α的mRNA表達量下降，與對照組相比差異顯著(P<0.05或P<0.01).

3 討論

3.1 復方中草藥制劑的抑菌作用

本試驗所用的菌株均從患臨床型乳房炎湖羊乳中分離鑒定得到，其中金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均為常見的乳房炎高致病菌，而糞腸球菌也是常見的乳房炎病原菌[11-12]，用復方中草藥制劑對這3種病原菌做藥敏測定，其結果對臨床試驗更具有參考意義.許多研究表明，中藥及其提取物可以直接殺滅病原菌或通過多種途徑提高機體免疫力達到防治疾病的效果[13-14].本研究采用相比于醇提法操作更為簡單、成本更為低廉的水提法提取白頭翁、柴胡、黃芪、當歸等6味中草藥的有效成分，進行乳房炎病原菌的體外抑菌試驗.抑菌結果顯示，復方中草藥制劑對引起湖羊乳房炎的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和糞腸球菌均有良好的抑制作用，對金黃色葡萄球菌抑制作用最強.與金蘭梅[15]研究結果基本一致.從本試驗研究可以認為該制劑對湖羊乳房炎主要致病菌金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和糞腸球菌均有很好的抑殺作用，對臨床上使用中草藥制劑防治湖羊乳房炎、篩選對乳房炎病原菌有良好抑殺作用的中草藥物進行防治湖羊乳房炎的獸藥研發具有一定的指導意義.

同一日齡不同處理組相比，* 表示差異顯著(P<0.05)；** 表示差異極顯著(P<0.01).Among different groups in the same day age，* indicate significant difference(P<0.05)；** indicate extremely significant difference(P<0.01).圖1 湖羊外周血中IL-2、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、TNF-α和IFN-γ在用藥前和用藥后的mRNA相對表達量Figure 1 The relative mRNA expression of IL-2，IL-6，IL-8，IL-10，IL-12，TNF-α and IFN-γ before and after medication in peripheral blood of Hu sheep

3.2 復方中草藥制劑對細胞因子的mRNA相對表達量的影響

細胞因子是由活化的免疫細胞和非免疫細胞經刺激而合成、分泌的一類具有多種生物活性的小分子蛋白質[16].可被分為白細胞介素、干擾素(IFN)、腫瘤壞死因子(TNF)、集落刺激因子(CSF)、趨化因子、生長因子等，具有間接反應動物細胞免疫功能的作用[17].而中草藥成分豐富，富含糖類、皂苷類、生物堿、揮發性物質和有機酸等多種免疫活性成分，不僅對疾病和病原微生物有抑制作用，還能調節畜禽體內細胞因子的生成和釋放、增強免疫和繁殖能力，具有良好的替抗潛力[18-20].Chu等[21]研究發現黃芪多糖、淫羊藿多糖、當歸多糖、蜂膠黃酮和黃芪總苷均可在體內和體外不同程度地提高T淋巴細胞中IL-2 mRNA的表達水平.在飼料中添加黃芪、當歸、柴胡、魚腥草等組成的中草藥制劑可提高雛雞脾臟中IL-2、IL-4和IFN-γ的mRNA表達量[22].而本研究使用復方中草藥制劑處理湖羊母羊后，發現該制劑可以在轉錄水平上提高湖羊外周血中IL-2、IL-8、IL-10、IL-12和IFN-γ的mRNA表達量(P<0.05)，降低IL-6和TNF-α的mRNA表達量(P<0.05)，該結果可以為該制劑在臨床上的應用提供試驗基礎.但是細胞因子基因的轉錄和表達受到多種因素的綜合調控，并且細胞因子之間作用效果、作用途徑也不盡相同[23].因此，該制劑的免疫機理研究還應聯合其他免疫效應，綜合分析，本次試驗結果為下一步工作提供了重要參考和啟示.

4 結論

復方中草藥制劑對引起湖羊乳房炎的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和糞腸球菌等有很好的抑殺作用，并可以上調IL-2、IL-8、IL-10、IL-12和IFN-γ的mRNA表達，下調IL-6、TNF-α的mRNA表達.