下瘀血湯抑制膠質細胞源性神經營養因子抗肝纖維化的作用機制

張 瑋， 楊廣越， 沈東曉， 馬文婷， 陶 樂， 吳 柳， 嚴 萍， 劉 成

上海中醫藥大學附屬普陀醫院 a.實驗中心肝病實驗室， b.感染科， 上海 200062

肝纖維化是機體對多種慢性損傷的一種修復應答，以細胞外基質過度沉積為特征[1]，可發展為肝硬化導致嚴重并發癥[2]，包括門靜脈高壓、肝衰竭和肝細胞癌[3]。膠質細胞源性神經營養因子(glial cell-derived neurotrophic factor，GDNF)是TGFβ超家族成員[4]，課題組前期發現GDNF通過ALK5/Smad信號促進肝星狀細胞(HSC)活化和肝纖維化[5]，因此抑制GDNF可能是抗肝纖維化的新靶點。

下瘀血湯出自漢·張仲景《金匱要略》，由大黃、桃仁、土鱉蟲3味中藥組成，三藥合用共奏活血化瘀之功，課題組前期用其治療肝纖維化取得了良好的臨床療效[6]，并發現下瘀血湯抗肝纖維化主要通過抑制NF-κB和TGFβ1/Smad信號通路[7]；減少腸上皮細胞凋亡，減輕緊密連接的破壞而抑制肝纖維化進展等[8]。但下瘀血湯是否能通過調控GDNF來抗肝纖維化還需要進一步探究。本文采用CCl4誘導的小鼠肝纖維化模型，以肝纖維化過程中GDNF表達及功能為切入點，觀察下瘀血湯通過抑制GDNF來抗肝纖維化的效應機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 雄性C57BL/6小鼠，清潔級，18～20 g，購自上海斯萊克實驗動物公司，生產許可證號：SYXK(滬)2017-0005。小鼠飼養于上海中醫藥大學附屬普陀醫院實驗動物中心，使用許可證號：SYXK(滬)2018-0032。飼養室環境溫度為(22±1)℃，相對濕度為30%～60%，12 h光照/12 h黑暗，自由進食和飲水。

1.1.2 細胞 GFP-Col-HSC細胞由美國加州大學圣地亞哥分校Ekihiro Seki教授饋贈，人原代HSC細胞購自Sciencell公司(貨號：5300)。GFP-Col-HSC細胞培養于2%FBS+1%青霉素和鏈霉素的DMEM中，人原代HSC細胞培養于10%FBS+1%青霉素和鏈霉素的DMEM中。

1.1.3 藥物 下瘀血湯所含的大黃、桃仁、地鱉蟲購自上海華宇藥業。下瘀血湯由上海中醫藥大學附屬曙光醫院制備，其制備過程如下：大黃2.0 kg、桃仁2.0 kg和地鱉蟲1.2 kg，分別加入8倍量20%乙醇浸泡1 h，回流提取2次，過濾收集藥汁；藥渣再加6倍量20%乙醇回流提取1 h，過濾收集藥汁。合并兩次所收集的藥汁、真空干燥，每克所含生藥量為8.889 g，臨用前配制成濃度為0.63 g/ml的藥液[8]。

1.1.4 試劑及耗材 CCl4和橄欖油購自上海凌峰化學試劑有限公司；ALT(貨號：C009-2-1)、AST(貨號：C010-2-1)試劑盒購自南京建成生物工程研究所；天狼星紅染色液由上海中醫藥大學劉平教授饋贈；SABC免疫組化試劑盒購自Vector公司；FBS購自TPCS公司；青霉素和鏈霉素及胰酶均購自美國Gibco公司；DMEM購自以色列BI公司；GDNF因子購自R&D公司；PVDF膜購自Millipore公司；BSA購自Amresco公司；ECL購自上海碧云天生物技術有限公司；平滑肌肌動蛋白(alpha-smooth muscle actin, α-SMA)兔單克隆抗體和GDNF兔多克隆抗體均購自Abcam公司；Trizol、High-Capacity cDNA反轉錄試劑盒及SYBR均購自日本TaKaRa公司；DAB購自北京中杉金橋公司；96孔板、6孔板均購自美國Corning公司；10 cm細胞培養皿購自NEST公司；引物購自生工生物工程公司(表1)。

1.1.5 主要儀器 超聲波細胞粉碎機、多功能酶標儀、超微量分光光度計、實時熒光定量PCR儀、脫水機、包埋機、輪轉式切片機、染色機、封片機等病理設備均購自德國Leica公司，熒光顯微鏡為日本Olympus公司(BX52)；蛋白電泳儀及濕轉儀均購自Bio-RAD公司，顯影儀購自美國GE公司。

表1 引物序列表

1.2 分組與造模處理 24只小鼠隨機分為對照組、模型組和下瘀血湯組，每組各8只，參考課題組前期文獻[7]，模型組和下瘀血湯組小鼠腹腔注射10% CCl4，每周3次，連續6周；對照組小鼠相同時間腹腔注射等體積橄欖油。造模第4周起，下瘀血湯組小鼠給予0.467 8 g/kg(相當于臨床等70 kg成人體質量的10倍量)灌胃，對照組和模型組給予等體積蒸餾水，1次/d，連續3周。實驗結束2%的戊巴比妥鈉麻醉后下腔靜脈取血，留取肝組織。選取肝右側最厚一葉于10%中性福爾馬林固定后用于組織學觀察，其余肝組織用液氮處理后保存于-80 ℃冰箱。

1.3 研究方法

1.3.1 肝功能檢測 血液樣本于室溫靜置3 h，3000 r/min離心10 min，取血清，檢測小鼠血清ALT和AST水平。

1.3.2 肝組織病理學蘇木素-伊紅(HE)染色 選取肝右側最厚一葉，取0.5 cm×0.4 cm×0.3 cm大小肝組織，固定于10%中性福爾馬林溶液，自動脫水機逐級乙醇脫水、二甲苯透明，石蠟包埋，4 μm切片，HE染色。采用OlympusBX43顯微鏡和CellSenStandard 9.0軟件和Olympus DP72拍照，隨機選取4個視野，進行圖片采集。

1.3.3 免疫組化 將制備的肝組織樣本脫蠟至水后，PBS洗3次，每次3 min；檸檬酸鈉溶液微波修復抗原(100%火力，10 min；轉換50%火力，5 min)，恢復至室溫，PBS洗3次；樣本上滴加3%過氧化氫，37 ℃孵育15 min；PBS洗；滴加5%BSA，37 ℃封閉30 min；滴加α-SMA(1∶500)、GDNF(1∶100)，4 ℃過夜；PBS洗；二抗37 ℃孵育30 min；PBS洗；滴加A+B試劑，37 ℃孵育30 min；PBS洗；滴DAB鏡驗；蘇木素復染20 s，水洗；脫水；透明；封片；顯微鏡下觀察。采用Image-pro plus 6.0軟件對α-SMA和GDNF陽性表達分析。

1.3.4 Western Blot與PCR檢測 取50 mg肝組織加入預冷的RIPA中勻漿，4 ℃ 12000 r/min離心15 min，取上清進行蛋白定量。取20 μg樣品，12% SDS-PAGE電泳，100 V轉移1 h至PVDF膜，5% BSA 封閉 1 h，一抗 4 ℃過夜，二抗室溫60 min，ECL顯影，采用 Image J分析Western Blot蛋白表達灰度值。(1)總RNA的提取：Trizol法提取小鼠肝臟RNA，總RNA溶解于DEPC水，采用超微量分光光度計測定A260/280 nm吸光度值，檢測RNA濃度；(2)逆轉錄：按TaKaRa逆轉錄試劑盒(RR037A)說明書操作，PCR反應條件為：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃ 15 min。(3) PCR擴增：cDNA 3 μl加SYBR Green 5 μl，引物0.8 μl，，ddH2O 1.2 μl，總體積10 μl，ABI(VIIA 7 DX)PCR系統擴增。PCR擴增條件為：預變性95 ℃ 30 min；變性95 ℃ 5 s，退火60 ℃ 30 s，40個循環，延伸60 ℃ 1 min。2ΔΔCt法分析結果。

1.4 倫理學審查 所有的研究規程均符合上海中醫藥大學動物倫理委員會當前的倫理考慮和《中國動物保護法》的程序和倫理指導方針，該法符合國家研究委員會的規定。所有動物實驗和程序均經上海中醫藥大學動物保護與利用委員會(IACUC)審查和批準，并按照有關指導方針和規章執行，倫理審查批號：PTEC-A-2016-4(G)-1。

2 結果

2.1 下瘀血湯對CCl4肝纖維化小鼠肝功能有顯著改善作用 與對照組小鼠相比，模型組ALT和AST水平顯著升高(P值均<0.001)；與模型組相比，下瘀血湯組小鼠血清ALT、AST水平顯著降低(P值均<0.01)，提示下瘀血湯對CCl4誘導的肝功能損傷具有保護作用(表2)。

表2 各組小鼠血清轉氨酶水平

2.2 下瘀血湯對CCl4肝纖維化的抑制作用 HE染色結果顯示，對照組肝細胞索從中央靜脈呈放射狀排列，CCl4造模6周后小葉間炎性細胞浸潤明顯，下瘀血湯可顯著抑制炎性浸潤(圖1a～c，表3)。天狼星紅染色結果顯示，CCl4造模6周，膠原纖維沉積顯著增多，正常結構遭到破壞，增生的膠原從匯管區向小葉延伸，形成肝纖維化，下瘀血湯顯著抑制膠原沉積(圖1d～f，表3)。

表3 各組小鼠炎性浸潤半定量及天狼星紅陽性半定量結果

2.3 下瘀血湯顯著抑制CCl4肝纖維化模型中HSC活化和GDNF表達 正常肝組織α-SMA 表達較低，主要表達在中央靜脈血管壁，造模6周，α-SMA呈強陽性表達，主要分布在纖維間隔和肝竇；下瘀血湯處理組α-SMA表達顯著下調。GDNF在正常小鼠肝組織表達較低，呈弱陽性表達；模型組小鼠肝組織GDNF主要表達肝小葉周圍，呈強陽性表達，位置與α-SMA表達位置類似(圖2，表4)。

表4 各組小鼠肝臟組織中α-SMA及GDNF含量半定量分析

免疫印跡結果顯示，對照小鼠肝組織GDNF表達比較低，CCl4造模6周肝纖維化形成，GDNF表達上調10倍左右，下瘀血湯顯著抑制GDNF蛋白表達。α-SMA和Col1表達在肝纖維化中顯著上調，下瘀血湯處理后α-SMA與Col1顯著下降(圖3，表5)。

圖3 α-SMA及GDNF在CCl4誘導肝纖維化中的免疫印跡(n=4)

表5 各組小鼠肝臟組織中α-SMA及GDNF含量灰度值半定量分析

2.4 下瘀血湯對GDNF誘導的HSC活化有抑制作用 用GDNF處理人原代HSC細胞2 h，發現磷酸化(p)NF-κB水平顯著升高，提示GDNF可誘導NF-κB活化，下瘀血湯處理后p-NF-κB水平顯著下調，提示下瘀血湯對GDNF誘導的NF-κB活化有顯著抑制作用；同樣GDNF可誘導TNFα表達顯著上調，而下瘀血湯可顯著抑制GDNF誘導的TNFα表達(圖4a，表6)。

GFP-Col-HSC細胞是小鼠源性的HSC株，當其活化時表達膠原Col和GFP。GFP-Col-HSC細胞培養48 h，不處理組GFP-Col-HSC細胞熒光強度相對較弱，而GDNF 10 ng/ml處理48 h，GFP-Col-HSC細胞熒光顯著增強，提示GDNF可誘導HSC活化；下瘀血湯處理后，GFP-Col-HSC熒光強度顯著下降，提示下瘀血湯對GDNF誘導的HSC活化有顯著的抑制作用(圖4c)。

進一步采用人原代HSC細胞，培養48 h，免疫印跡結果發現α-SMA和Col1表達上調2.7倍和4.8倍，提示GDNF可誘導人HSC活化，下瘀血湯處理后α-SMA和Col1表達顯著下調，提示下瘀血湯對GDNF誘導的人HSC活化有顯著抑制作用(圖4b，表6)。實時定量PCR結果與免疫印跡結果類似，Col4 A2和Col5 A1在GDNF刺激后顯著上調，而下瘀血湯顯著抑制GDNF誘導的Col4 A2和Col5 A1表達(表7)。

表6 體外實驗中炎癥因子及纖維化指標灰度值半定量分析

表7 體外實驗中纖維化相關因子mRNA相對表達量比較

注：a，人原代HSC細胞在GDNF(10 ng/ml)濃度下處理2 h; b, 免疫印跡檢測α-SMA和Col1表達及半定量結果；c,GDNF處理GFP-Col-HSC細胞48 h，檢測熒光。

3 討論

在我國慢性乙型肝炎是肝纖維化主要病因，近年乙型肝炎疫苗的廣泛應用，乙型肝炎肝纖維化顯著減少[9]，然而，生活節奏改變誘發的非酒精性脂肪性肝病[10]、酒精性脂肪性肝病[11]、藥物性肝損傷、自身免疫性肝炎等慢性肝病不斷增多，這些慢性肝病均可誘發肝纖維化，進而誘發門靜脈高壓和肝癌[3]。肝纖維化的細胞學基礎是HSC，在持續的慢性肝損傷情況下，HSC及Kuffer細胞及肝細胞分泌TGFβ，通過自分泌或旁分泌途徑刺激HSC活化，進而分泌膠原致細胞外基質增多和肝纖維化[12]。肝纖維化的細胞學基礎明確，然而仍然缺乏有效的生物或化學藥物干預，提示肝纖維化的病因研究有待進一步深入。目前明確了肝纖維化發生的中心環節是HSC激活，激活的 HSC 是肝纖維化過程中細胞基質外主要來源，TGFβ是致 HSC激活的最強因子，但由于 TGFβ細胞分布的廣泛性，靶向 TGFβ分子的生物制劑很難走向臨床應用。因此，這就要求從新的視角，進一步闡明 HSC 激活機制，以便為其有效防治提供新靶點。

下瘀血湯是抗肝纖維化經典方劑，已故名醫姜春華教授用下瘀血湯治療血吸蟲性肝纖維化取得較好的臨床療效[13]。本課題組發現下瘀血湯對膽總管結扎誘導肝纖維化[14]及蛋氨酸-膽堿缺乏飲食誘導的脂肪變及纖維化有顯著抑制作用[15]，并對肝纖維化過程中的其他臟器損傷也有顯著的保護作用[16]。本研究肝功能、天狼星紅染色等結果驗證了下瘀血湯抗肝纖維化作用，與前期結果一致[14-15]。基礎研究結果為下瘀血湯臨床應用提供了依據，并且下瘀血湯僅有三味中藥組成，較容易闡明藥物的有效成分，有巨大的開發潛力，因此，進一步闡明下瘀血湯的作用機制具有重要意義。

GDNF是TGFβ超家族成員[4]，TGFβ是最強致纖維化因子，但是TGFβ分布組織廣泛，缺乏組織和細胞特異性，針對TGFβ靶向的試劑很難走向臨床，需要尋找細胞特異性較好的致纖維化新靶點。本研究顯示GDNF主要分布在小葉間，與α-SMA分布相似，體外GDNF處理GFP-Col-HSC及人原代HSC 48 h，膠原表達上調，提示GDNF可誘導HSC細胞活化，具有致纖維化作用，與文獻報道GDNF可促進纖維化反應作用一致[5,17-18]。GDNF相對TGFβ有致纖維化作用并具特異性，本課題組發現了HSC活化的這個新靶點，為中醫藥抗肝纖維化提供了新的靶標。

本研究創新之處是發現GDNF處理HSC 2 h后，NF-κB磷酸化水平和TNFα表達顯著增高，提示GDNF可經過NF-κB通路誘導HSC活化，下瘀血湯可顯著抑制GDNF誘導的NF-κB通路從而抗肝纖維化，因此，在一定程度上闡明了下瘀血湯抗肝纖維化的作用機制。據報道GDNF在炎性疼痛中發揮重要作用[19]，前期本組報道下瘀血湯可顯著改善慢性乙型肝炎患者肝區不適、脅痛等臨床癥狀[6]，因此，GDNF也可能是脅痛的病理基礎之一，也是下瘀血湯取效的靶點之一。總之，本研究發現GDNF在肝纖維化過程中上調并可經過NF-κB誘導HSC活化，下瘀血湯抑制GDNF的表達從而實現抗肝纖維化效應，為未來臨床應用下瘀血湯抗肝纖維化提供了基礎依據，但下瘀血湯抗纖維化機制及有效成分的作用需要進一步深入研究。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監護人以及與公開研究成果有關的利益沖突，特此聲明。

作者貢獻聲明：張瑋負責課題設計，資料分析，撰寫論文；楊廣越、沈東曉、嚴萍負責分子生物學相關實驗及動物實驗；馬文婷、陶樂、吳柳參與收集數據，修改論文；劉成負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。