人附睪蛋白4、CA199、LPA在卵巢癌中的表達及與臨床病理特征的相關性

王 秀，劉 真，吳晶晶，王秀麗，烏日娜

卵巢癌是女性生殖系統中較為常見的一種惡性腫瘤，其發病率僅次于宮頸癌、子宮體癌，此病具有疾病隱匿、早期癥狀不明顯的特點，且目前臨床上對于卵巢癌無特異性的診斷指標，大多數病人在疾病診斷時已經處于晚期，錯過了最佳的治療時機，病人預后較差，病死率較高[1]。因此尋找有效的診斷卵巢癌的敏感指標，對病人的早期診斷及治療具有重要的意義。有研究[2]采用人附睪蛋白4(HE4)、糖類抗原125(CA125)、人溶血磷脂酸(LPA)對上皮性卵巢癌病人進行聯合診斷，其研究結果中認為HE4在卵巢癌組織中高表達，與卵巢癌細胞所分泌的LPA升高共同參與此病的發生。亦有研究[3]認為，HE4與糖類抗原199(CA199)相關，共同參與卵巢癌的發生，可作為卵巢癌的早期診斷指標。另外有研究[4]發現，LPA、CA199與上皮性卵巢癌病人治療效果相關，可作為病人病情診斷指標。基于上述研究，本文旨在探討HE4、CA199及LPA在卵巢癌中的表達及與臨床病理特征的相關性，以期為臨床上卵巢癌的早期診治提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2018年1月至2019年4月于唐山市婦幼保健院就診的卵巢癌病人140例作為卵巢癌組，年齡34～65歲，平均年齡(49.5±2.5)歲；FIGO臨床分期：Ⅰ期15例，Ⅱ期21例，Ⅲ期45例，Ⅳ期59例；病理類型：漿液性囊腺癌76例，黏液性囊腺癌32例，卵巢子宮內膜樣癌32例；分化程度：低分化53例，中分化46例，高分化41例；腫瘤直徑：≥5 cm 59例，<5 cm 81例；有淋巴結轉移62例，無淋巴結轉移78例。同期選取唐山市婦幼保健院因卵巢良性病變而行手術切除的病人120例作為卵巢良性病變組，年齡30～65歲，平均年齡(48.6±2.6)歲。另外同期選取在唐山市婦幼保健院行健康體檢女性100名作為健康對照組，年齡35～60歲，平均年齡(48.9±2.5)歲。3組研究對象年齡差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本次研究所有研究及其家屬均知情，并簽署了知情同意書，且經過醫院倫理委員會批準。

1.2 納入及排除標準 納入標準：卵巢癌組病人均經臨床、組織病理、免疫組織化學、影像學等手段確診。卵巢良性病變組病人經病理證實為卵巢良性病變。健康對照組肝腎功能正常，婦科檢查無異常，無家族腫瘤史。排除標準：其他腫瘤病人；嚴重內科基礎疾患如冠心病、心力衰竭等；肝腎功能不全者；合并其他器官惡性腫瘤存在者。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集 取3組研究對象清晨空腹靜脈血5 mL，在取血1 h內分離出血清、血漿，在-80 ℃環境下保存。取卵巢癌組、卵巢良性病變組病人手術切除的卵巢組織，在10%中性甲醛中固定，固定處理24 h后行常規的石蠟包埋處理，制作組織切片，厚度為4 μm，用于后續免疫組織化學(免疫組化)染色。

1.3.2 HE4、CA199、LPA表達水平的檢測 血清HE4表達水平采用ELISA法檢測，血清CA199表達水平采用電化學發光法檢測，血漿LPA表達水平采用無機定磷法檢測。

1.3.3 免疫組化 將所制備的卵巢癌組、卵巢良性病變組卵巢組織石蠟切片在二甲苯中重復脫蠟處理10 min，行梯度乙醇水化，將蛋白酶修復液加入在37 ℃的恒溫冰箱中行孵化30 min，去除抗原修復液，將所制備的切片轉移至內含3% H2O2的濕盒中，去過氧化物酶封閉液密封，在37 ℃的恒溫冰箱中行孵化10 min，PBS清洗。清洗完成后將山羊血清加入，在室溫下封閉處理30 min，用濾紙將封閉液吸處除，加入一抗，放入至適合后加入二抗，在室溫下孵育處理1 h，PBS清洗，DAB顯色處理10 min，梯度乙醇脫水，二甲苯沖洗片3次一直到透明，采用中性樹脂封片處理，顯微鏡下觀察免疫組化染色情況。每份標本在鏡頭下隨機選擇5個視野，所有病理切片均由2位以上經驗豐富的醫師采用雙盲法進行確診。根據染色程度和染色細胞百分比進行評分：不著色0分，淡黃色1分，黃色2分，棕黃色3分；著色細胞數≤5% 0分，6%～25% 1分，26%～50% 2分，≥51% 3分。得分≤1分為陰性(-)，2～3分為弱陽性(+)；4～5分為中度陽性(2+)；≥6分為強陽性(3+)。

1.4 統計學方法 采用t檢驗、方差分析、q檢驗、χ2檢驗和Pearson相關性分析。

2 結果

2.1 3組研究對象血清HE4、CA199、血漿LPA水平的比較 血清HE4、CA199、血漿LPA水平，卵巢癌組血清均高于卵巢良性病變組和健康對照組，卵巢良性病變組均高于健康對照組(P<0.05)(見表1)。

表1 3組研究對象血清HE4、CA199、血漿LPA水平的比較

2.2 HE4、CA199、LPA在卵巢良性病變組與卵巢癌組卵巢組織中的陽性表達情況比較 HE4、CA199、LPA在卵巢癌組卵巢組織中的陽性表達率均顯著高于卵巢良性病變組(P<0.01)(見表2、圖1～3)。

表2 HE4、CA199、LPA在卵巢良性病變組與卵巢癌組卵巢組織中的陽性表達情況比較[n；百分率(%)]

2.3 HE4、CA199、LPA水平與卵巢癌病人臨床病理特征的相關性分析 HE4、CA199、LPA表達與卵巢癌病人病理類型、腫瘤直徑無相關性(P>0.05)，與卵巢癌病人臨床分期、分化程度、有無淋巴結轉移有相關性(P<0.01)；其中臨床分期Ⅲ～Ⅳ期、低分化程度、有淋巴結轉移的卵巢癌病人HE4、CA199、LPA表達較高(見表3)。

表3 HE4、CA199、LPA水平與卵巢癌病人臨床病理特征的相關性分析

2.4 HE4、CA199、LPA之間相關性分析 HE4、CA199、LPA之間進行Pearson相關性分析，HE4與CA199呈現顯著正相關關系(r=0.183,P<0.05)，HE4與LPA呈顯著正相關關系(r=0.216,P<0.05)，CA199與LPA之間呈正相關(r=0.209,P<0.05)。

3 討論

卵巢癌具有發病隱匿的特點，早期無特異性癥狀，加之臨床上缺乏早期診斷的指標，導致多數病人預后大多不良，因此提高卵巢癌的早期診斷對病人預后治療具有重要的作用。

HE4最早在1991年被KIRCHOFF等發現于附睪遠端的上皮細胞中，屬于核心表位蛋白2基因的編碼產物，其全長為12 kb，是由4個內含子和5個外顯子所組成的，在多種剪切方式中所存在，對含有乳清酸型4個二硫鍵核心域的蛋白質具有編碼作用[5-6]。HELLSTROM等在2003年最先將HE4應用于診斷卵巢癌，認為HE4在卵巢癌病人中呈現為異常高表達，使得HE4這一新型腫瘤標志物成為卵巢癌診斷的熱點。目前研究[7-8]認為，HE4在多種惡性腫瘤中均出現異常高表達，與病人疾病進展具有一定的相關性。賀帥等[9]研究認為HE4在卵巢癌病人血清中、癌組織中均呈現為高表達。本文研究結果顯示，與卵巢良性病變病人和健康女性相比，卵巢癌病人血清中HE4水平均較高；與卵巢良性病變病人相比，卵巢癌病人卵巢組織中HE4陽性表達率較高，與上述研究結果一致。另外本文進一步分析HE4與卵巢癌病人臨床病理特征的相關性，結果顯示，HE4與卵巢癌病人臨床分期、分化程度、有無淋巴結轉移相關，此結果說明，HE4參與卵巢癌的發生和發展。馬書麗等[10]研究認為，HE4的異常表達與病人臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期、組織學分級為中、低分化、有淋巴結轉移、死亡有關，本文與其研究結果一致。

CA199屬于一種糖抗原，是與膽囊癌、胰腺癌、結腸癌、胃癌等腫瘤相關的腫瘤標志物，在臨床上又被稱為胃腸癌相關抗原，是一種由單克隆抗體116NS19-9所識別的抗原成分，在健康人血清中CA199值為0～37 U/mL[11]。李煒等[12]研究認為CA199可用于卵巢癌的診斷。李丹妍等[13]在其研究中認為CA199在卵巢癌病人中為高表達。本文結果顯示，CA199在卵巢癌病人中高表達，且與病人疾病分期、分化程度以及是否存在淋巴結轉移相關，與上述研究結果中認為CA199可作為卵巢癌淋巴結轉移的血清標志物的結果一致。

LPA屬于一類脂類小分子，其結構較為簡單，具有多種信號轉導的作用，被臨床上稱為“磷脂信使”，在機體處于正常生理條件下，其在血漿中的表達較低，當機體細胞癌變，惡性腫瘤形成后病人血漿中LPA表達顯著升高，目前研究[15-16]認為，LPA參與癌細胞的生物學行為過程，LPA表達的高低與腫瘤病人預后情況不良或者良好相關。已有研究[17-19]發現，LPA在卵巢癌的發生發展過程中具有重要的作用，可通過G蛋白所介導的不同種信號通路而發揮其自身生物學效應；LPA參與卵巢癌發生發展的途徑包括兩方面，一方面在機體血小板被活化后會產生較多不同種的溶血磷脂，此時的溶血磷脂會轉換為LPA，使其高表達；另一方面當癌細胞中的磷脂酶A2活性增強后會促進LPA的過量分泌，在卵巢組織中聚集，而卵巢組織中過量的LPA會重復產生LPA，形成惡性循環，介導卵巢癌的發生。本文結果顯示，LPA在卵巢癌病人中高表達，且與病人疾病分期、分化程度以及是否存在淋巴結轉移相關，此結果提示著，LPA參與卵巢癌的形成，可作為此類病人早期診斷的敏感指標。

本研究通過對HE4、CA199、LPA進行相關性分析，結果顯示，HE4、CA199、LPA三者之間均呈現為正相關。說明HE4、CA199、LPA在卵巢癌的發展中起到重要的調控作用，可以作為卵巢癌早期診治的敏感指標。

綜上所述，HE4、CA199、LPA在卵巢癌病人中為高表達，且與病人臨床分期、分化程度、有無淋巴結轉移相關。