GOLPH3和VEGF在宮頸癌組織中的表達(dá)及臨床意義

蘇文芳

宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤。全世界每年大約有53萬宮頸癌新發(fā)病例和27萬死亡病例，約85%死亡病例發(fā)生在發(fā)展中國家[1]。宮頸癌發(fā)病逐年呈年輕化、上升趨勢。盡管宮頸癌現(xiàn)在治療方法上有手術(shù)治療、化療、放療、靶向治療等多種治療方式，但宮頸癌發(fā)生浸潤、轉(zhuǎn)移率仍較高。因此有必要對宮頸癌進(jìn)行深入研究。明確宮頸癌的浸潤、轉(zhuǎn)移發(fā)生機(jī)制，并采取恰當(dāng)?shù)闹委煷胧m頸癌病人的治療有著重要意義。

高爾基體磷酸化蛋白(Golgi phosphoprotein3，GOLPH3)最初在小鼠的高爾基體蛋白質(zhì)分析時發(fā)現(xiàn)，被稱為GMx33、GPP34和MIDAS，與酵母Vps74同源。后來經(jīng)研究[2]發(fā)現(xiàn)，它可以調(diào)節(jié)高爾基質(zhì)蛋白磷酸化，又命名為高爾基磷酸化蛋白3。GOLPH3是一種高爾基基質(zhì)蛋白，相對分子質(zhì)量約34 000，該蛋白由5p13基因編碼，從酵母到人類高度保守[3]。GOLPH3基因是新發(fā)現(xiàn)的致癌基因。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是一種可通過旁分泌方式作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的糖蛋白，可以通過誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞的分化和成熟，促進(jìn)新生血管的形成，增加血管的通透性，從而促進(jìn)癌細(xì)胞通過血管進(jìn)行轉(zhuǎn)移[4]，還可促進(jìn)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞增生，在多種腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移中具有重要作用[5]。目前針對GOLPH3和VEGF兩者在宮頸癌中的表達(dá)關(guān)系國內(nèi)鮮見報道。本研究通過免疫組織化學(xué)的方法檢測宮頸癌組織中GOLPH3 和VEGF蛋白表達(dá)情況，探討兩者在宮頸癌組織中表達(dá)的相關(guān)性，從而為宮頸癌發(fā)生、發(fā)展、浸潤、轉(zhuǎn)移、治療提供理論依據(jù)和新的思路。

1 資料與方法

1.1 病理資料 隨機(jī)選取2018年3月至2019年8月蚌埠醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科宮頸癌病人行改良廣泛全子宮切除術(shù)/廣泛行全子宮切除術(shù)+盆腔淋巴結(jié)清掃術(shù)病人術(shù)后病理標(biāo)本43例。所有病人術(shù)前均未進(jìn)行化療和放療，術(shù)前、術(shù)后均行病理檢查，術(shù)后病理報告證實(shí)腫瘤大小、病理類型、分化程度、手術(shù)病理分期、淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移。43例病人年齡36～68歲；其中鱗癌40例，腺癌3例；病理分級：高、中分化20例，低分化23例。臨床分期：ⅠA2期～ⅠB2期27例，ⅡA1期～ⅡA2期16例，術(shù)后經(jīng)病理證實(shí)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移31例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移12例。臨床病理分期根據(jù)2009年國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)分期。病人臨床病理資料均完整。

1.2 主要試劑 兔抗人GOLPH3多克隆抗體、兔抗人VEGF單克隆抗體購自proteintech公司，生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體，鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶免疫組織化學(xué)試劑盒、二氨基聯(lián)苯顯色劑購自北京中杉金橋生物有限公司。

1.3 實(shí)驗方法 所有標(biāo)本術(shù)后均經(jīng)10%甲醛液固定，石蠟包埋，連續(xù)切片，切片厚度4 μm，切片經(jīng)脫蠟、脫水、水化、熱抗原修復(fù)，阻斷內(nèi)抗原性過氧化酶活性，滴加非免疫動物血清、一抗、二抗、鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶溶液，經(jīng)DAB溶液染色、蘇木精復(fù)染乙醇脫水干燥后，后經(jīng)二甲苯透明、中性樹膠封片，在顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.4 染色結(jié)果判斷 由2名經(jīng)驗豐富的病理醫(yī)生在雙盲的情況下，對每張病理切片進(jìn)行染色和細(xì)胞陽性率評分。在400倍鏡下每張切片隨機(jī)選取5個視野進(jìn)行觀察，計數(shù)至少500個腫瘤細(xì)胞中陽性細(xì)胞的表達(dá)率。GOLPH3、VEGF陽性蛋白表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核染色，評分標(biāo)準(zhǔn)：不著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕色為3分。陽性細(xì)胞比例：不著色為0分，<10%為1分，10%～35%為2分，36%～70%為3分，70%為4分，兩者得分相乘>4分為陽性表達(dá)，≤4分為陰性表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用χ2檢驗和Pearson相關(guān)性分析。

2 結(jié)果

2.1 宮頸癌組織及癌旁組織中GOLPH 和VEGF的表達(dá)情況 GOLPH3主要定位于細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色顆粒(見圖1A)，在宮頸癌組織中陽性表達(dá)率72.09%，明顯高于宮頸癌旁組織的37.21%(P<0.01)。VEGF主要定位于細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色顆粒(見圖1C)，在宮頸癌組織中陽性表達(dá)74.42%，明顯高于宮頸癌旁組織中陽性表達(dá)率 32.56%(P<0.01)(見表1)。

表1 GOLPH3、VEGF在子宮頸癌及癌旁組織中的表達(dá)情況(n)

2.2 GOLPH3、VEGF表達(dá)分別與宮頸癌各臨床病理特征之間的關(guān)系 宮頸癌組織中GOLPH3和VEGF的表達(dá)與病人的年齡、腫瘤病理類型無相關(guān)性(P>0.05)，與宮頸癌病人的腫瘤大小、分化程度、手術(shù)病理分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有相關(guān)性(P<0.05～P<0.01)。GOLPH3、VEGF在腫瘤直徑>4 cm陽性表達(dá)率明顯高于腫瘤直徑≤4 cm(P<0.05～P<0.01)，GOLPH3、VEGF在低分化宮頸癌組織中陽性表達(dá)率高于高、中分化宮頸癌組織(P<0.05)；GOLPH3、VEGF在宮頸癌ⅡA1期～ⅡA2期中的陽性表達(dá)率高于宮頸癌ⅠA2期～ⅠB2期(P<0.05)；GOLPH3、VEGF在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的陽性表達(dá)率明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(P<0.05～P<0.01)(見表2)。

表2 GOLPH3和VEGF與宮頸癌各臨床病理因素的關(guān)系

2.3 GOLPH3、VEGF在宮頸癌組織中表達(dá)的相關(guān)性 免疫組織化學(xué)法顯示，在GOLPH3陽性表達(dá)組的宮頸癌組織中VEGF陽性表達(dá)率為83.87 %(26/31)，明顯高于GOLPH3陰性表達(dá)組33.33%(4/12)(P<0.01)。Pearson相關(guān)性分析顯示，GOLPH3蛋白的表達(dá)與VEGF的表達(dá)呈正相關(guān)性(r=0.494,P<0.01)(見表3)

表3 GOLPH3、VEGF在子宮頸癌組織中表達(dá)的相關(guān)性

3 討論

SCOTT等[6]對多種實(shí)體腫瘤的5p13基因拷貝數(shù)增加進(jìn)行系統(tǒng)分析，并通過基因敲除實(shí)驗發(fā)現(xiàn)GOLPH3是新的致癌基因，具有影響腫瘤細(xì)胞分化、增殖的作用，促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡的作用。GOLPH3通過參與高爾基體囊泡的轉(zhuǎn)運(yùn)、蛋白質(zhì)的糖基化等參與腫瘤的形成。研究[7-9]表明GOLPH3在正常組織中無表達(dá)或低表達(dá)，而在宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌中呈高表達(dá)。其高表達(dá)與相關(guān)惡性腫瘤的腫瘤大小、病理分級、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。SCOTT等[6]研究亦發(fā)現(xiàn)GOPLH3過表達(dá)時腫瘤體積變大、細(xì)胞周期縮短，基因敲除降低GOLPH3表達(dá)時，腫瘤體積縮小。抑制GOLPH3表達(dá)，可降低細(xì)胞的增殖活力和遷移能力。證實(shí)GOLPH3具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡的作用。正常細(xì)胞失去凋亡功能，會導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、浸潤、轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果顯示，GOLPH3在宮頸癌組織中陽性表達(dá)率72.09%，明顯高于宮頸癌旁組織37.21%，GOLPH3的高表達(dá)與宮頸癌的腫瘤大小、分化程度、手術(shù)病理分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)性。

VEGF是已知的在腫瘤血管生成中作用最強(qiáng)的血管生成誘導(dǎo)因子。VEGF是一種通過旁分泌方式作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的糖蛋白，可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移、血管生長，并促進(jìn)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和淋巴管增生，在多種惡性腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移中具有重要作用[4-5]。VEGF受多種因素的調(diào)控，缺氧是導(dǎo)致VEGF分泌的重要因素[10]。宮頸癌細(xì)胞的增殖、生長會消耗大量的氧氣與營養(yǎng)，從而導(dǎo)致缺氧和供血不足，宮頸癌血管組織紊亂，導(dǎo)致缺氧微環(huán)境形成，宮頸癌細(xì)胞在缺氧環(huán)境時，會引起缺氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)的釋放，使HIF-1α高表達(dá)，引起其下游靶基因VEGF的表達(dá)增加，促進(jìn)宮頸癌新生血管生成、增加血管通透性，侵襲能力增強(qiáng)，造成宮頸癌的侵襲、轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果顯示，VEGF的表達(dá)在宮頸癌組織的陽性表達(dá)率明顯高于宮頸癌旁組織的陽性表達(dá)率，VEGF的高表達(dá)與宮頸癌病人的腫瘤大小、病理分級、手術(shù)病理分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，VEGF的高表達(dá)促進(jìn)了宮頸癌的浸潤、轉(zhuǎn)移。

本研究結(jié)果顯示GOLPH3和VEGF與宮頸癌的腫瘤大小、分化程度、手術(shù)病理分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，二者在宮頸癌的浸潤、轉(zhuǎn)移中有協(xié)同作用。經(jīng)相關(guān)性分析GOLPH3、VEGF在宮頸癌中呈正相關(guān)性。其機(jī)制GOLPH3通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target ofrapamycin,mTOR)通路，促進(jìn)了VEGF表達(dá)。PI3K/AKT/mTOR信號通路是細(xì)胞調(diào)節(jié)增殖、侵襲的關(guān)鍵信號通路，宮頸癌病情進(jìn)展過程中PI3K/AKT/mTOR信號通路的過度激活能改變多種增殖侵襲基因的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖、侵襲[11]。細(xì)胞外基質(zhì)的水解是促進(jìn)癌細(xì)胞侵襲的基本環(huán)節(jié)，細(xì)胞外基質(zhì)的水解及細(xì)胞運(yùn)動均需要腫瘤新生血管來提供營養(yǎng)及能量。GOLPH3有促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡的作用。細(xì)胞異常增殖，凋亡減少時會發(fā)生癌變，宮頸癌細(xì)胞生長時會消耗氧氣與營養(yǎng)，從而導(dǎo)致缺氧和供血不足，缺氧時會刺激HIF-1α的表達(dá)，HIF-1α在氧濃度低于6%時才表達(dá)，HIF-1α在腫瘤缺氧環(huán)境中促進(jìn)VEGF對腫瘤內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)，刺激腫瘤血管生長，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞大量生長與增殖[12]造成宮頸癌細(xì)胞的浸潤、轉(zhuǎn)移。

綜上所述，宮頸癌組織中GOLPH3、VEGF的陽性表達(dá)與宮頸癌的浸潤、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，提示二者在宮頸癌的浸潤、轉(zhuǎn)移中有協(xié)同作用，在宮頸癌組織中過表達(dá)的GOLPH3能上調(diào)VEGF的表達(dá)，從而促進(jìn)宮頸癌組織中新生血管形成，促進(jìn)宮頸癌的浸潤、轉(zhuǎn)移。中斷腫瘤血管的血供、阻止血管形成可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的壞死、抑制腫瘤細(xì)胞生長。VEGF現(xiàn)被認(rèn)為是腫瘤治療的抗血管治療靶點(diǎn)。VEGF拮抗劑如:伐珠單抗、舒尼替尼、索拉非尼、阿帕替尼已在臨床應(yīng)用，并對治療腫瘤的浸潤、轉(zhuǎn)移取得了較好的治療效果。因此，聯(lián)合檢測GOLPH3和VEGF的表達(dá)，對明確宮頸癌浸潤、轉(zhuǎn)移機(jī)理，臨床預(yù)后的判斷及豐富宮頸癌的靶向治療有一定的臨床指導(dǎo)意義。