LncRNA PCBP1-AS1對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡的影響

于 宇，李曉寧

口腔鱗狀細(xì)胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)屬于頭頸部常見惡性腫瘤之一[1]。臨床主要采用手術(shù)與化療等手段治療OSCC，但由于缺乏早期診斷OSCC的有效標(biāo)志物導(dǎo)致大部分病人確診時(shí)已處于中晚期，目前關(guān)于OSCC發(fā)生及轉(zhuǎn)移機(jī)制尚未完全闡明。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，LncRNA)可調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄、翻譯等生物學(xué)過程，LncRNA表達(dá)異常與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[2-3]。研究[4]表明長鏈非編碼RNA PCBP1-AS1(long non-coding RNA PCBP1-AS1，LncRNA PCBP1-AS1)可抑制外陰鱗癌細(xì)胞增殖、侵襲及遷移并促進(jìn)其凋亡。近來報(bào)道指出PCBP1-AS1在口腔鱗癌中呈低表達(dá)，但關(guān)于其具體作用機(jī)制尚未闡明[5]。Janus激酶2(JAK2)/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)信號(hào)通路可參與細(xì)胞增殖、凋亡等多種生物學(xué)過程，JAK2可促使STAT3活化從而促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展[6-7]。但PCBP1-AS1是否可通過調(diào)控JAK2/STAT3信號(hào)通路而參與OSCC發(fā)生發(fā)展進(jìn)程尚需進(jìn)一步研究。本研究主要探討PCBP1-AS1在OSCC細(xì)胞中的表達(dá)狀態(tài)及其對(duì)細(xì)胞增殖、侵襲及凋亡的影響，初步探究其對(duì)JAK2/STAT3信號(hào)通路的調(diào)控作用，旨在為揭示OSCC發(fā)生發(fā)展機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 正常口腔上皮細(xì)胞HOK與口腔鱗癌細(xì)胞株CAL-27、Tca8113、KB購自美國ATCC公司。杜氏改良培養(yǎng)基(DMEM)、胰蛋白酶購自美國Gibco公司；pcDNA3.1購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green試劑盒購自日本TaKaRa公司；甲基噻唑基四唑(methylthiazolyl tetrazolium，MTT)購自美國APExBIO公司；細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自上海澤葉生物科技有限公司；Transwell小室購自美國Corning公司；Mgtrigel基質(zhì)膠購自美國BD公司；蛋白裂解液與二 喹 啉 甲 酸(BCA)蛋白定量試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)研究所；兔抗人細(xì)胞周期依賴蛋白激酶1(CDK1)、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)、B淋巴細(xì)胞瘤-2(Bcl-2)、B淋巴細(xì)胞瘤-2相關(guān)蛋白(Bax)單抗購自美國CST公司；兔抗人Janus激酶2(JAK2)及其磷酸化激酶(p-JAK2)單抗購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；鼠抗人信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)及其磷酸化(p-STAT3)單抗購自美國Santa Cruz公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔、山羊抗鼠IgG二抗均購自北京義翹神州科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組 細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件：37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱，傳代培養(yǎng)至第3代時(shí)。收集對(duì)數(shù)生長期CAL-27細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化，加入DMEM培養(yǎng)基制備細(xì)胞懸液接種于24孔板，待細(xì)胞生長融合至50%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染前更換為不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，隨機(jī)分為pcDNA-control組(細(xì)胞中轉(zhuǎn)染pcDNA-control)、pcDNA-PCBP1-AS1組(細(xì)胞中轉(zhuǎn)染PCBP1-AS1過表達(dá)質(zhì)粒)，各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染6 h后更換為含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測細(xì)胞中PCBP1-AS1表達(dá)水平 收集各組細(xì)胞，根據(jù)Trizol試劑盒說明書操作提取細(xì)胞總RNA，應(yīng)用Nanodrop2000c超微量分光光度計(jì)測定RNA濃度，將RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，PCBP1-AS1正向引物5′-TGC CAA GAG CCT ATC CAT TC-3′，反向引物：5′-TCA CTC CCT TCA CCC TGT CT-3′；GAPDH正向引物5′-GCA CCG TCA AGG CTG AGA AC-3′，反向引物：5′-TGG TGA AGA CGC CAG TGG A-3′，引物由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計(jì)合成。以cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件：95 ℃ 2 min，95 ℃ 30 s，60 ℃30 s，72 ℃ 30 s，循環(huán)35次。PCBP1-AS1以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算PCBP1-AS1相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3 MTT檢測細(xì)胞增殖 收集各組對(duì)數(shù)生長期CAL-27細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化，制備單細(xì)胞懸液(3×104個(gè)/毫升)，接種至96孔板(每孔200 μL)，分別于轉(zhuǎn)染24、48、72 h時(shí)每孔分別加入20 μL MTT溶液，室溫孵育4 h，棄上清液，每孔分別加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)，低速振蕩10 min，酶標(biāo)儀檢測各孔吸光度值(OD490 nm)。

1.2.4 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲 預(yù)備實(shí)驗(yàn)：培養(yǎng)液預(yù)冷一定時(shí)間，以9∶1的比例稀釋Matrigel基質(zhì)膠，按照每孔40 μL的密度將Matrigel基質(zhì)膠稀釋液平鋪于Transwell小室上室，37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱孵育5 h。實(shí)驗(yàn)步驟：取對(duì)數(shù)生長期CAL-27細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化，加入不含胎牛血清的培養(yǎng)液制備單細(xì)胞懸液(5×104個(gè)/毫升)，取200 μL接種于Transwell小室上室，另取500 μL含有10%胎牛血清的培養(yǎng)液加入Transwell小室的下室，37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱孵育24 h，PBS洗滌，多聚甲醛固定20 min，0.1%結(jié)晶紫染液染色10 min，濕棉簽擦去小室內(nèi)未侵襲細(xì)胞，顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野觀察侵襲細(xì)胞數(shù)。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率 分別取各組對(duì)數(shù)生長期CAL-27細(xì)胞，預(yù)冷PBS清洗，加入500 μL結(jié)合緩沖液，依次加入5 μL 膜聯(lián)蛋白V(Annexin V)-異硫氰酸熒光素(FITC)與5 μL碘化丙啶(PI)，室溫避光孵育10 min，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.2.6 蛋白免疫印跡(Western blotting)檢測CDK1、MMP-2、Bcl2、Bax、JAK2/STAT3信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá) 收集各組口腔鱗癌CAL-27細(xì)胞，加入蛋白裂解液，冰上裂解30 min提取細(xì)胞總蛋白，測定蛋白濃度時(shí)嚴(yán)格按照BCA試劑盒說明書進(jìn)行操作，100 ℃高溫煮沸蛋白變性，按照每孔加入30 μg蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉2 h，孵育一抗稀釋液(CDK1稀釋比1∶800，MMP-2、Bcl2、Bax、p-JAK2、p-STAT3稀釋比1∶1 000，內(nèi)參β-actin稀釋比1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，TBST洗滌3次×15 min，孵育二抗稀釋液(1∶2 000)，孵育1 h，TBST洗滌，曝光，顯影，凝膠成像分析系統(tǒng)及應(yīng)用ImageJ軟件分析各條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用t檢驗(yàn)、單因素方差分析、LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 PCBP1-AS1在口腔鱗癌細(xì)胞株中的表達(dá) 與正常口腔上皮細(xì)胞HOK相比，口腔鱗癌細(xì)胞CAL-27、Tca8113、KB中PCBP1-AS1的表達(dá)水平顯著降低(P<0.01)，PCBP1-AS1在口腔鱗癌CAL-27細(xì)胞中的表達(dá)水平相對(duì)降低，因而選用口腔鱗癌CAL-27細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)研究(見表1)。

表1 qRT-PCR檢測口腔鱗癌細(xì)胞株中PCBP1-AS1的表達(dá)

2.2 PCBP1-AS1對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞CAL-27增殖的影響 pcDNA-control組與pcDNA-PCBP1-AS1組細(xì)胞中PCBP1-AS1表達(dá)量分別為1.00±0.13和3.05±0.38，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。相較于pcDNA-control組，pcDNA-PCBP1-AS1組口腔鱗癌CAL-27細(xì)胞增殖活力顯著降低(P<0.01)(見表2)。

表2 PCBP1-AS1過表達(dá)對(duì)CAL-27細(xì)胞增殖的影響

2.3 PCBP1-AS1對(duì)CAL-27細(xì)胞侵襲的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與pcDNA-control組相比，pcDNA-PCBP1-AS1組口腔鱗癌CAL-27細(xì)胞侵襲數(shù)顯著減少(P<0.01)(見圖1、表3)。

表3 PCBP1-AS1過表達(dá)對(duì)CAL-27細(xì)胞侵襲的影響

2.4 PCBP1-AS1對(duì)CAL-27細(xì)胞凋亡的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相較于pcDNA-control組，pcDNA-PCBP1-AS1組口腔鱗癌CAL-27細(xì)胞凋亡率顯著增加(P<0.01)(見圖2、表4)。

表4 PCBP1-AS1過表達(dá)對(duì)CAL-27細(xì)胞凋亡的影響

2.5 PCBP1-AS1對(duì)CAL-27細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與pcDNA-control組相比，pcDNA-PCBP1-AS1組口腔鱗癌CAL-27細(xì)胞中CDK1、MMP-2、Bcl2蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.01)，Bax蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.01)(見圖3、表5)。

表5 PCBP1-AS1過表達(dá)對(duì)CAL-27細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影

2.6 PCBP1-AS1對(duì)CAL-27細(xì)胞JAK2/STAT3信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相比于pcDNA-control組，pcDNA-PCBP1-AS1組口腔鱗癌CAL-27細(xì)胞中p-JAK2、p-STAT3蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.01)，JAK2、STAT3蛋白表達(dá)水平無明顯變化(P>0.05)(見圖4、表6)。

表6 PCBP1-AS1對(duì)CAL-27細(xì)胞JAK2/STAT3信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3 討論

OSCC具有惡性程度高、浸潤性強(qiáng)等特點(diǎn),導(dǎo)致病人極易出現(xiàn)復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移，病人生存期較短且預(yù)后較差[8]。既往研究[9-10]顯示LncRNA表達(dá)異常與OSCC發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。因此從LncRNA角度分析OSCC發(fā)病機(jī)制對(duì)早期診斷OSCC及評(píng)估病人預(yù)后均具有重要意義。

PCBP1-AS1在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中呈低表達(dá)，并可能參與腫瘤發(fā)生發(fā)展過程，PCBP1-AS1還可能在癌癥等相關(guān)疾病發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[11-12]。為探究其表達(dá)水平及作用機(jī)制，本研究檢測口腔鱗癌細(xì)胞系中PCBP1-AS1的表達(dá)量，結(jié)果顯示PCBP1-AS1在口腔鱗癌細(xì)胞中的表達(dá)水平顯著低于正常口腔上皮細(xì)胞，提示PCBP1-AS表達(dá)水平降低可能促進(jìn)OSCC的發(fā)生。本研究通過上調(diào)PCBP1-AS1表達(dá)分析其對(duì)口腔鱗癌CAL-27細(xì)胞增殖、侵襲及凋亡的影響，結(jié)果顯示PCBP1-AS1過表達(dá)可抑制CAL-27細(xì)胞增殖、侵襲，并可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，提示PCBP1-AS1過表達(dá)可降低OSCC細(xì)胞增殖及侵襲能力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。同時(shí)本研究進(jìn)一步檢測細(xì)胞增殖、侵襲及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示PCBP1-AS1過表達(dá)后細(xì)胞中CDK1、MMP-2、Bcl2蛋白表達(dá)水平顯著降低，Bax蛋白表達(dá)水平顯著升高。CDK1可促進(jìn)細(xì)胞周期由G2期進(jìn)入M期從而促進(jìn)細(xì)胞增殖，MMP-2可通過降解細(xì)胞外基質(zhì)從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移，Bcl2與Bax在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用，Bax蛋白表達(dá)升高可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，Bcl2可抑制Bax表達(dá)從而發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡作用[13-15]。因此，PCBP1-AS1過表達(dá)可通過上調(diào)Bax表達(dá)及下調(diào)CDK1、MMP-2、Bcl2表達(dá)從而減弱OSCC細(xì)胞增殖及侵襲能力，提高細(xì)胞凋亡水平。

JAK2/STAT3信號(hào)通路中STAT3經(jīng)磷酸化的方式活化后可參與腫瘤細(xì)胞增殖、遷移及血管生成等多種生物學(xué)過程，研究表明通過JAK2/STAT3信號(hào)通路可參與結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移及侵襲過程[16]。JAK2/STAT3信號(hào)通路還可參與肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展過程[17]。研究[18]報(bào)道指出抑制JAK2/STAT3信號(hào)通路可抑制多發(fā)性骨髓瘤生長并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示PCBP1-AS1過表達(dá)后CAL-27細(xì)胞中p-JAK2、p-STAT3蛋白表達(dá)水平顯著降低，說明PCBP1-AS1過表達(dá)抑制JAK2/STAT3信號(hào)通路激活。提示PCBP1-AS1過表達(dá)可能通過抑制JAK2/STAT3信號(hào)通路而影響OSCC細(xì)胞增殖、侵襲及凋亡行為。

綜上所述，PCBP1-AS1過表達(dá)能夠抑制OSCC細(xì)胞增殖、侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能與抑制JAK2/STAT3信號(hào)通路激活有關(guān)，可為靶向治療OSCC提供潛在靶點(diǎn)。但關(guān)于PCBP1-AS1如何調(diào)控下游miRNA/靶基因表達(dá)尚未可知，本研究僅從體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探討PCBP1-AS1對(duì)OSCC的作用，仍需進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)及臨床研究進(jìn)一步明確PCBP1-AS1在OSCC發(fā)生發(fā)展中的重要作用。