卡介苗對(duì)支氣管哮喘大鼠氣道重塑及血清HIF-1α表達(dá)的影響

王 磊，沈懷云，陳 信，諸宏偉，徐家新，鄭迎娟，陳 云，宣愛麗，徐家麗

支氣管哮喘因嚴(yán)重影響病人的生活質(zhì)量及遠(yuǎn)期預(yù)后，已成為呼吸系統(tǒng)常見的慢性疾病之一[1]。尤其是兒童病人，因臨床表現(xiàn)及發(fā)作形式多樣化，且患兒就診時(shí)對(duì)于病史及癥狀描述不確切，更是增加了診斷的難度，導(dǎo)致診治不及時(shí)，隨著病程的遷延，患兒出現(xiàn)進(jìn)行性加重的氣道狹窄和不可逆性的氣道重塑。因此，早期診斷和治療兒童支氣管哮喘的重要性不言而喻。促使哮喘向慢性疾病演變的重要因素在近年來的研究中被發(fā)現(xiàn)，主要是由于氣道炎癥及氣道重塑，它們?cè)谙l(fā)展過程中起著重要的病理生理作用[2]。有研究[3]表明，卡介苗(bacillus calmette-guerin,BCG)通過免疫調(diào)節(jié)，發(fā)揮其減輕氣道上皮細(xì)胞損傷及間質(zhì)轉(zhuǎn)化的作用，從而減輕哮喘性氣道炎癥和氣道阻塞，但目前國(guó)內(nèi)外對(duì)BCG在改善氣道重塑的作用機(jī)制方面進(jìn)行報(bào)道的相關(guān)文獻(xiàn)較少。本研究著重探討在BCG干預(yù)下，支氣管哮喘大鼠氣道重塑情況以及血清缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia-inducible factor-1 alpha，HIF-1α)的表達(dá)情況，旨在為臨床控制哮喘癥狀、改善哮喘病人預(yù)后提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)，現(xiàn)作報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取清潔級(jí)健康雄性SD大鼠30只，10～12周齡，由維通利華廠家提供，在層流實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行喂養(yǎng)，提供喂養(yǎng)所需的專用飼料及專用水。

1.2 實(shí)驗(yàn)主要材料 BCG，購(gòu)自成都生物制品研究所有限責(zé)任公司；卵白蛋白(OVA)，購(gòu)自索萊寶公司；氫氧化鋁，購(gòu)自天津化學(xué)試劑三廠；二甲苯、無水乙醇購(gòu)自中國(guó)國(guó)藥；Citrate 檸檬酸鹽緩沖液(pH6.0)、PBS 磷酸鹽緩沖液(pH 7.2～7.4)、蘇木素染液、中性樹膠，購(gòu)自中杉金橋生物科技有限公司；大鼠HIF-1α檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自上海西唐生物科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)主要器材 全自動(dòng)脫水機(jī)(ASP200S)、石蠟切片機(jī)(RM2235)、烤片臺(tái)(HI1220)、水浴缸(HI1220)、加熱石蠟包埋系統(tǒng)(G1150 H)，正置熒光顯微鏡(DM3000)，均產(chǎn)自德國(guó)萊卡(Leica)設(shè)備有限公司；酶標(biāo)儀(Spectra Max M5)，產(chǎn)自Molecular Devices公司；空氣壓縮霧化器(PARIBOYNO56)，產(chǎn)自德國(guó)百瑞公司。

1.4 方法

1.4.1 動(dòng)物分組 將30只SD大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分成對(duì)照組、哮喘組和BCG治療組，每組10只。飼養(yǎng)條件為室溫20 ℃左右、空氣濕度60%左右的清潔環(huán)境，在光照-黑暗各交替12 h條件下分籠飼養(yǎng)，獨(dú)自攝食和飲水，各組大鼠用藥前均測(cè)量體重，實(shí)驗(yàn)過程中嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作原則。

1.4.2 動(dòng)物模型建立 哮喘組大鼠在第1天和第8天，腹部皮膚消毒，腹腔注射10% OVA+氫氧化鋁混合液(每毫升0.9%氯化鈉溶液含100 mg OVA和100 mg氫氧化鋁干粉)1 mL致敏。從第15天開始用1% OVA(每毫升0.9%氯化鈉溶液含10 mg OVA)進(jìn)行霧化吸入，每天1次，每次20 min，共2周，使大鼠致敏；當(dāng)大鼠出現(xiàn)口唇發(fā)紺、呼吸急促、肢體抽動(dòng)、喘息、打噴嚏、煩躁不安等癥狀時(shí)，表明激發(fā)試驗(yàn)成功。對(duì)照組大鼠制模方法同哮喘組，在相同的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行腹腔注射和霧化吸入處理，但區(qū)別在于使用的是0.9%氯化鈉溶液來替代OVA和氫氧化鋁。BCG治療組大鼠制模方法同哮喘組，每天霧化前半小時(shí)使用BCG 0.025 mg[4]進(jìn)行皮內(nèi)注射。

1.4.3 標(biāo)本制作 在末次激發(fā)后24 h，對(duì)3組大鼠進(jìn)行標(biāo)本收集。(1)血清標(biāo)本：采用乙醚吸入的方法將大鼠進(jìn)行吸入麻醉，當(dāng)大鼠四肢松弛，刺激無疼痛反射后，取仰臥位固定在解剖板上，在劍突下呈V字形剪開皮膚，剪斷兩側(cè)胸廓暴露心臟，用枸櫞酸鈉抗凝管在心尖處使用真空采血針采取約5 mL新鮮血液，輕輕晃動(dòng)試管，使血液與抗凝劑充分混勻，在20 ℃冰箱中放置30 min，4 000 r/min離心15 min。使用一次性清潔吸管從離心完成后的標(biāo)本吸取上清液于容積2 mL的EP管中，放置在-80 ℃冰箱保存，備用，以進(jìn)一步檢測(cè)HIF-1α。(2)肺組織標(biāo)本：采血結(jié)束后快速進(jìn)行氣管和肺組織分離，操作過程中需注意輕柔以避免肺組織損傷。首先用血管鉗在剪下右肺前夾閉右側(cè)主支氣管，用0.9%氯化鈉溶液沖洗剪下的右肺，然后將肺組織表面液體用無菌紗布吸干，在4%多聚甲醛中浸泡48 h固定標(biāo)本，梯度乙醇脫水和二甲苯進(jìn)行透明處理，石蠟包埋。組織切片宜選取右肺中葉，切片厚度為3 μm，烤片后備用。

1.4.4 HE染色 肺組織切片常規(guī)脫蠟至水，在配置好的Weigert鐵蘇木素中染色5～10 min；用酸性乙醇分化液分化，水洗；用Masson藍(lán)化液返藍(lán)，水洗1 min；蒸餾水洗1 min；麗春紅品紅染色液染色時(shí)間為5～10 min；在上述操作過程中將蒸餾水∶弱酸溶液按照2∶1的比例配置成弱酸工作液，用弱酸工作液洗1 min；磷鉬酸溶液洗1～2 min；用配置好的弱酸工作液洗1 min；直接入苯胺藍(lán)染色液中染色1～2 min；用配置好的弱酸工作液洗1 min；95%乙醇快速脫水；無水乙醇脫水3次，每次5～10 s；二甲苯透明3次，每次1～2 min；中性樹膠封固。

1.4.5 ELISA檢測(cè) 取大鼠血清，嚴(yán)格按照試劑盒說明，采用雙抗體夾心ABC-ELISA法測(cè)定HIF-1α的血清含量,記錄數(shù)據(jù)。

1.5 觀察指標(biāo) 運(yùn)用圖像分析軟件測(cè)量支氣管內(nèi)徑周長(zhǎng)(Pi)、支氣管管壁面積(WAt)、支氣管平滑肌總面積(WAm)等指標(biāo)，并將測(cè)量所得的WAt值和 WAm值用Pi進(jìn)行標(biāo)化，分別代表支氣管管壁厚度(WAt/Pi)，支氣管平滑肌厚度(WAm/Pi)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用方差分析和q檢驗(yàn)、Pearson相關(guān)性分析。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)比較 通過光學(xué)顯微鏡進(jìn)行觀察，對(duì)照組大鼠肺組織肺泡形態(tài)正常，排列均勻，肺泡壁未見明顯增厚，氣管及血管結(jié)構(gòu)均正常；哮喘組大鼠肺組織肺泡壁有明顯增厚，視野可見大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，氣管腔內(nèi)可見明顯黏液殘留，模型構(gòu)建成功；BCG治療組大鼠肺組織整體結(jié)構(gòu)趨于正常，表明BCG對(duì)大鼠哮喘有治療作用(見圖1)。

2.2 3組大鼠ELISA檢測(cè)結(jié)果 3組大鼠血清HIF-1α表達(dá)水平比較，哮喘組> BCG治療組>對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(見表1)。

表1 3組大鼠血清HIF-1α表達(dá)水平比較

2.3 3組大鼠肺組織氣道形態(tài)學(xué)指標(biāo)變化情況 與對(duì)照組比較，哮喘組和BCG治療組大鼠WAt/Pi均升高(P<0.01和P<0.05)，哮喘組大鼠WAm/Pi升高(P<0.01)；與哮喘組比較，BCG治療組大鼠WAt/Pi和WAm/Pi均降低(P<0.01和P<0.05)(見表2)。

表2 3組大鼠WAt/Pi和WAm/Pi的比較

2.4 3組大鼠HIF-1α的表達(dá)水平與氣管形態(tài)學(xué)變化指標(biāo)的相關(guān)性分析 結(jié)果顯示，大鼠血清HIF-1α與支氣管壁厚度和支氣管平滑肌厚度之間呈正相關(guān)(r=0.618、0.503，P<0.01)。

3 討論

支氣管哮喘的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升趨勢(shì)，其發(fā)病率升高的原因可能和感染、環(huán)境污染、全球氣候變化以及霧霾天氣影響等諸多因素具有一定的相關(guān)性[5]。而且由于本病易反復(fù)發(fā)作，病程遷延，嚴(yán)重影響病人的生活質(zhì)量及遠(yuǎn)期預(yù)后，已成為呼吸系統(tǒng)常見的慢性疾病之一。目前哮喘防治的重要參考指南主要依據(jù)全球哮喘防治創(chuàng)議(Global Initiative for Asthma,GINA)方案[1]，并處于不斷更新中，中華醫(yī)學(xué)會(huì)兒科學(xué)分會(huì)呼吸學(xué)組則制定了《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南》[6]。控制哮喘發(fā)作藥物及緩解病情藥物是該指南中治療支氣管哮喘的主要藥物分類，這些藥物主要用于控制哮喘的氣道炎性反應(yīng)以及氣道痙攣，在哮喘急性發(fā)作期控制臨床癥狀，在臨床緩解期則用于預(yù)防喘息的急性發(fā)作。但是隨著近年來研究的不斷深入發(fā)現(xiàn)，隨著病程的進(jìn)展，哮喘的可逆性氣流受限是可以發(fā)展為不可逆轉(zhuǎn)的肺功能損害的。此類支氣管哮喘病人，通常存在病情嚴(yán)重、病程時(shí)間長(zhǎng)、主動(dòng)或被動(dòng)吸煙、持續(xù)接觸過敏源和職業(yè)刺激物、持續(xù)的氣道內(nèi)炎癥性反應(yīng)等諸多因素中的一項(xiàng)或多項(xiàng)。并且近年來研究發(fā)現(xiàn)哮喘發(fā)病的各個(gè)環(huán)節(jié)中均伴有氣道重塑的參與，因此認(rèn)識(shí)到氣道炎癥及氣道重塑在哮喘的病理生理發(fā)展過程中同時(shí)進(jìn)行[7]，共同參與了哮喘的發(fā)病過程。

活的牛型結(jié)核桿菌在體外經(jīng)230代減毒培養(yǎng)后制成的活BCG，在臨床上主要用于免疫接種，以預(yù)防人類結(jié)核病的發(fā)病。死BCG則由活BCG經(jīng)高溫滅活而成，除了短時(shí)間內(nèi)用于結(jié)核免疫外，目前多數(shù)用于呼吸道疾病的輔助治療，可用于治療支氣管哮喘等自身免疫性疾病[8]。

機(jī)體在缺氧狀態(tài)下產(chǎn)生的HIF-1α是一種氧依賴性轉(zhuǎn)錄激活因子，是缺氧條件下關(guān)鍵細(xì)胞存活蛋白，已被確定為介導(dǎo)細(xì)胞對(duì)缺氧反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)錄因子，廣泛參與機(jī)體的炎癥和免疫反應(yīng)，在不同條件下促進(jìn)細(xì)胞存活和凋亡。HIF-1α在嗜酸性粒細(xì)胞趨化性中的作用曾由LAURA等[9]在研究髓系細(xì)胞HIF-1α誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)哮喘發(fā)病機(jī)制的作用中做過首次評(píng)估，嗜酸性粒細(xì)胞HIF-1α的缺失可降低其趨化性，證實(shí)了髓系細(xì)胞中的HIF-1α在哮喘發(fā)病機(jī)制中起著重要作用，特別是在氣道高反應(yīng)的發(fā)展中起著重要作用。減輕過敏性氣道炎癥反應(yīng)及新生血管形成[10-11]，可通過抑制HIF-1α的表達(dá)或其活性而實(shí)現(xiàn)。

本研究發(fā)現(xiàn)，在BCG的干預(yù)下，治療組大鼠肺組織整體結(jié)構(gòu)趨于正常，相對(duì)于哮喘組大鼠肺組織肺泡壁明顯增厚、大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、氣管腔可見明顯黏液殘留等情況而言，BCG對(duì)大鼠哮喘有明確的治療作用。同時(shí)BCG干預(yù)組大鼠血清中HIF-1α的表達(dá)水平較哮喘組出現(xiàn)明顯降低，說明BCG能夠有效減輕過敏性氣道炎癥反應(yīng)及新生血管形成，抑制氣道上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,減緩氣道重塑，是通過抑制哮喘大鼠血清中HIF-1α表達(dá)而發(fā)揮作用，證實(shí)了BCG治療支氣管哮喘的臨床可行性。

本研究項(xiàng)目的意義在于為BCG在臨床上治療支氣管哮喘提供理論依據(jù)，減輕患兒家庭的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，減少醫(yī)療資源浪費(fèi)，對(duì)提高患兒的生活質(zhì)量及遠(yuǎn)期預(yù)后，有著重要而深遠(yuǎn)的意義。