基于基質膠體外構建結腸癌類器官的初步研究

王 寧，曹 博，鄧 歡，崔 昊，張慶鵬，陳潤開

1 解放軍總醫院第一醫學中心 普通外科醫學部，北京 100853；2 解放軍總醫院研究生院，北京100853；3 南開大學醫學院，天津 300071

結腸癌是臨床上最常見的惡性消化道腫瘤之一[1-2]，在我國發病率高居惡性腫瘤第3 位，由于結腸癌早期缺乏典型癥狀，部分患者接受治療時已處于中晚期[3]。多數結腸癌患者手術治療后需要輔助化療，以增加存活時間[4-5]。因此深入研究新的結腸癌化療藥物具有十分重要的意義。類器官技術是近年來興起的一種新型體外組織培養技術，具有還原度高、培養周期短等優勢[6-9]。2011 年，Sato 等[10]利用小腸類器官培養體系探索并建立了結腸、結腸癌類器官的培養體系。本研究根據既往文獻報道的方法，結合自身實驗條件成功在體外構建了人結腸腺癌類器官。

材料與方法

1 主要試劑 Advanced DMEM/F-12(Thermo Fisher公司，美國)，GlutaMAX(1×；Thermo Fisher 公司，美國)，HEPES(1×；Thermo Fisher 公司，美國)，N2-Supplement (Thermo Fisher 公司，美國)，B-27 Supplement (Thermo Fisher 公司，美國)；人重組堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF；Sigma-Aldrich 公司，美國)；人重組表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF；Sigma-Aldrich 公司，美國)；青鏈霉素(雙抗；Solarbio 公司，中國)，胎牛血清(Thermo Fisher 公司，美國)，基質膠(Corning 公司，美國)；0.25%胰酶(Solarbio公司，中國)；山羊抗兔EDA 抗體(Abcam 公司，美國)；山羊抗兔CK18 抗體(Abcam 公司，美國)；山羊抗兔IgG H&L(Alexa Fluor?488；Abcam 公司，美國)；(順)二氨二氯鉑(MedChemExpress 公司，美國)，人結腸腺癌細胞HCT116 購自協和細胞資源中心。

2 人結腸腺癌細胞HCT116 的培養與類器官條件培養基配制 HCT116 復蘇后按1×105/mL 接種于細胞培養瓶中增殖，使用含10%胎牛血清的DMEM/F-12 培養基，待生長密度接近70%時傳代；根據Sato 等[10]的研究結合本實驗室既往研究，使用的類器官培養基配方如下：含10%胎牛血清的DMEM/F12 為基礎培養基，GlutaMAX (1×)，HEPES (1×)，B-27 Supplement (1×)，N2-Supplement (1×)，Penicillin-Streptomycin Liquid (1×)，bFGF (20 ng/mL)，EGF (50 ng/mL)。

3 體外結腸癌類器官的構建將基質膠置于4℃提前溶解，96 孔板、離心管提前-20℃預冷。HCT116 按1×104/mL、1×105/mL、1×106/mL 密度重懸，取25 μL 細胞懸液與同體積基質膠充分混合均勻后加入96 孔板中，則終密度為5×103/mL、5×104/mL、5×105/mL，全程冰上操作并防止有氣泡產生。將96 孔板置于37℃培養箱孵育30 min，待其充分凝固，每孔加100 μL 類器官培養基覆蓋液滴，37℃培養箱培養，每2 d 換液1 次。顯微鏡下觀察類器官形態變化，測量類器官直徑。

4 結腸癌類器官的藥物處理 類器 官培養3 d后，光鏡下觀察可見多細胞團樣結構，培養基中加入抗腫瘤藥物(順)二氨二氯鉑(15 μg/mL)，每24 h 換液1 次，分別于24 h、48 h 觀察比較類器官形態變化。

5 結腸癌類器官切片及HE 染色 棄掉培養基，加100 μL 4%多聚甲醛固定液，使用100 μL 槍頭輕柔地重懸類器官和基質膠，將混合物轉移至EP 管中輕輕混合，放在冰上孵育至少1 h。4℃，1500 r/min，離心5 min，吸出固定液和基質膠。瓊脂糖固定后進行石蠟包埋、脫水、切片。標本石蠟切片后進行HE 染色，切片脫蠟至水后蘇木素溶液染細胞核，伊紅染細胞質，染色完成后進行脫水，使用中性樹膠封片，使用倒置顯微鏡進行觀察。

6 統計學分析 采用SPSS22.0 軟件進行統計分析。計量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗和方差分析。P＜0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1 結腸癌細胞HCT116 在2D 及3D 條件下培養的形態特征對比 在2D 條件下結腸癌HCT116 細胞呈上皮樣細胞形態貼壁生長，形態相對規則的多變形(圖1)。在基質膠中生長3 d 后，形成多細胞球形團狀結構。通過持續對結腸癌類器官進行間斷觀察可以發現，不同接種密度(圖2)對類器官的發育也存在一定的影響，過高的培養密度抑制了類器官的生長。培養6 d 時，肉眼觀察可見到針尖樣大小的白色囊狀結構(圖3A)，呈彌漫樣均勻分布生長于基質膠中。光鏡(60×)觀察培養3 d 的類器官外觀形態仍呈較為規則的球形(圖3B)，培養6 d 時類器官已經發育為形態不規則的團塊(圖3C)，甚至部分類器官發育出分葉狀結構(圖3D，箭頭)。

圖 1 結腸癌細胞HCT116 在2D (A)及3D (B)條件下培養的形態特征對比(倒置顯微鏡)Fig.1 Morphological characteristics of HCT116 cells in 2D (A) and 3D (B) culture (inverted microscope)

圖 2 結腸癌類器官不同密度下培養連續性觀察(倒置顯微鏡，4× )Fig.2 Continuous observation on colon cancer organoids cultured at different densities (inverted microscope, 4×)

圖 3 結腸癌類器官培養3 d、6 d 時形態特征變化(倒置顯微鏡，光鏡下20×)A：結腸癌類器官肉眼觀；B：結腸癌類器官培養3 d 形態特征；C、D：結腸癌類器官培養6 d 形態特征Fig.3 Morphological characteristics of colon cancer organoids cultured for 3 and 6 days (inverted microscope, 20×)A: visual observation; B: morphological changes at 3 days; C, D: morphological changes at 6 days

圖 4 結腸癌類器官直徑統計分析(aP＜0.01)Fig.4 Statistical analysis of organoid diameter (aP＜0.01)

2 類器官形態發育分析 在培養6 d 時不同培養密度下發育的類器官直徑大小分布大致符合正態分布(圖4A)。對直徑150 μm 以上類器官占比分析發現，5×104/mL 組和5×105/mL 組無統計學差異(P＞0.05)，而5×103/mL 組直徑在150 μm 的類器官數量占比相對減少(P＜0.05，圖4B)。

3 HE 染色觀察 對培養6 d 的結腸癌類器官包埋切片后進行HE 染色，可以發現結腸癌類器官呈囊狀結構，細胞排列相對不規則，腺腔結構呈不規則環狀，與結腸癌生物學特征相似。見圖5。

4 順鉑對人結腸癌類器官生長的影響 在培養至第6 天的結腸癌類器官培養基中加入(順)二氨二氯鉑(15 μg/mL)。光鏡下觀察培養24 h 的類器官發現其形態(圖6B)較空白對照組(圖6A)紊亂且出現部分類器官死亡，繼續培養48 h 后觀察發現類器官大部分已經出現崩解破碎，基本失去了類器官的團塊狀結構(圖6C)。

圖 5 結腸癌類器官HE 染色觀察(bar=100μm)Fig.5 HE staining images of colon cancer organoids (bar=100 μm)

圖 6 順鉑對人結腸癌類器官生長的影響(倒置顯微鏡，光鏡下4×)A：類器官加藥前狀態；B：類器官加藥24 h 狀態；C：類器官加藥48 h 狀態Fig.6 Effect of cisplatin on colon cancer organoid (inverted microscope, 4×)A：control；B：adding cisplatin for 24 hours；C：adding cisplatin for 48 hours

討 論

目前結腸癌治療的方案中，手術切除癌灶后輔助化療、免疫治療及靶向治療是非常重要的一環，有利于提高患者生存周期。然而長期化療導致結腸癌對化療藥物耐藥性不斷提高，極大影響了治療效果進而縮短了患者生存率[11-12]。因此，深入研究結腸癌耐藥機制、開發新的靶向藥物具有重要的現實意義[13]。

目前，抗結腸癌化療藥物的相關研究多以結腸癌細胞系或人體腫瘤組織動物移植模型進行[14]。但上述兩種方式均存在短板，細胞系無法模擬體內腫瘤生長的生物學特性和個體腫瘤異質性，而動物模型移植率低，且實驗周期長，可能出現動物特異性腫瘤進化，因而許多藥物的臨床試驗結果往往不及腫瘤模型試驗效果。類器官技術的迅速發展為結腸癌模型建立和新型藥物篩選提供了極大幫助，類器官較傳統腫瘤培養方式可更好地模擬機體腫瘤組織三維環境和生長特點，能夠更加準確和多維度地展現腫瘤對藥物的反應[15-18]。本研究的意義在于探索建立一種體外環境下程序化的結腸癌類器官培養技術方案，并且探索了適宜的培養密度，發現當結腸癌細胞密度≤5×103/mL 時類器官的發育緩慢，可能是培養密度過低時缺乏細胞間相互交流，生長物質過度彌散所致，與2D 環境下細胞培養規律相似。另外，本研究確認了常用的鉑類化療藥物順鉑同樣對結腸癌類器官具有殺傷作用。為結腸癌藥物篩選、腫瘤行為學觀察和信號通路研究提供理想的體外模型。

此外，McCray 等[19]將體外培養的類器官進行單細胞測序以鑒別不同的細胞種群。Wu 等[20]和Miyoshi 等[21]分別通過對腎類器官進行轉錄組學分析以探索類器官發育過程中相關信號通路網絡。而本實驗尚未對類器官及對應的腫瘤組織進行轉錄組學分析比較，這是本實驗的不足之處，我們將在后續實驗中進一步分析體外構建的類器官與對應原腫瘤組織在基因水平上的差異，以明確該模型的優勢發展方向。其次，國內外關于結腸癌類器官的構建仍無工程化培養流程，基質膠濃度及細胞培養密度、培養時間等存在較大差異，其次種子細胞的處理不當、培養密度以及添加生長因子等問題也會在很大程度上的影響結腸癌類器官構建的成功率。

總體而言，本研究提供了一種利用結腸腺癌細胞系進行體外結腸癌類器官培養的可行方法，所建立的結腸癌類器官將為結腸癌基礎研究提供新的理想體外模型，并可應用于結腸癌新靶向藥物篩選和高通量測序分析。