人HPIP 基因真核表達載體的構建及其對肺癌細胞的生物學影響

葛祥偉，張德宇，翟今朝，盧 迪，葉棋濃，汪進良

1 解放軍醫學院，北京 100853；2 解放軍總醫院第五醫學中心 腫瘤醫學部，北京 100071；3 軍事科學院 軍事醫學研究院 生物工程研究所 細胞工程研究室，北京 100850

最新數據顯示，2020 年世界肺癌新發病例約為220 萬例，居全球惡性腫瘤發病率第2 位；死亡病例數近180 萬例，居癌癥死亡率第1 位[1]。盡管已有手術、放化療、靶向治療、免疫治療等多種手段應用于臨床治療，但由于肺癌起病隱匿且預后較差，肺癌患者的5 年生存率仍低于20%[2-4]。因此，探索肺癌發生發展的分子機制，識別新的分子標志物和潛在的治療靶點對于應對肺癌的治療現狀至關重要。人造血前B 細胞白血病轉錄因子相互作用蛋白(hematopoietic pre-B-cell leukemia transcription factor interacting protein，HPIP)是利用酵母雙雜交技術通過人類造血cDNA 文庫篩選確定的前B 細胞白血病轉錄因子1(pre-B-cell leukemia transcription factor，PBX1)的輔阻遏物[5]。既往研究報道HPIP 在多種腫瘤中表達上調，如肝細胞癌、胃癌、乳腺癌、腎細胞癌及結直腸癌等[6-9]。Mai 等[10]發現HPIP 在腎細胞癌中異常高表達并能夠與酪蛋白激酶1α (casein kinase 1α，CK1α)相互作用，進而促進腎細胞癌的增殖和轉移。然而HPIP 在肺癌中的作用還有待闡明。本研究通過構建帶有Flag 標簽的HPIP 基因真核表達載體，并以肺癌A549 細胞為研究對象，探討HPIP 對肺癌細胞增殖、遷移能力的影響，為進一步研究肺癌發生發展的作用機制提供理論依據。

材料與方法

1 主要材料和試劑 肺癌A549 細胞株(中國科學院上海細胞研究所)；胰酶、胎牛血清、PBS 緩沖液和RPMI 1640 培養基(美國Gibco 公司)；人乳腺文庫和pcDNA3.0-Flag 載體由本實驗室前期保存；PCR 試劑、T4-DNA 連接酶、限制性核酸內切酶(寶日醫生物技術北京有限公司)；DH5α 感受態細胞(博邁德基因技術有限公司)；膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒(美國Promega 公司)；CCK-8試劑盒(日本Dojindo 公司)；Transwell 小室(美國Corning 公司)；4%多聚甲醛(武漢塞維爾生物技術有限公司)；抗Flag 抗體(英國Abcam 公司)；引物序列由北京博邁德基因技術有限公司合成。

2 HPIP 基因編碼序列擴增 根據HPIP 基因的編碼序列進行引物設計合成，其中上游引物為5?-CCC AAGCTTATGGACCCAGAATCTGAGAGAG-3?(酶切位點：Hind Ⅲ)，下游引物為5?-CGGATATCCT CAGCCCCGGTGGTGGTG-3?(酶切位點：EcoR Ⅴ)。以實驗室保存的人乳腺文庫為模板進行PCR 擴增，反應過程：95℃預變性5 min；95℃變性30 s；62℃退火30 s；72℃延伸2 min 6 s；30 個循環后，72℃延伸7 min。用1%瓊脂糖凝膠進行電泳鑒定，并用膠回收試劑盒收集PCR 產物。

3 重組質粒pcDNA3.0-Flag-HPIP 的構建和鑒定

采用限制性核酸內切酶Hind Ⅲ和EcoRⅤ對pcDNA3.0-Flag 載體和HPIP 基因的PCR 產物進行酶切。回收產物后，利用T4-DNA 連接酶在16℃條件下連接6 h。酶連體系：HPIP 酶切產物11.5 μL，酶切載體1 μL，T4 連接酶1 μL，T4 Buffer 1.5 μL。將重組質粒經DH5α 感受態細胞轉化，涂板后挑取克隆進行菌液PCR 鑒定(其中陰性對照以雙蒸水為模板，陽性對照以乳腺文庫為模板)，之后提取質粒。隨后用HindⅢ和EcoRⅤ進行雙酶切鑒定，鑒定成功后送至公司測序。

4 細胞培養 肺癌A549 細胞株使用含10%胎牛血清的RPMI 1640 培養基培養，置于37℃、5% CO2培養箱中。待細胞密度達80%~90%時，用0.25%的胰酶消化傳代。

5 細胞轉染 將生長狀態良好的肺癌A549 細胞接種于6 cm 培養皿中，當細胞密度達到80%時進行轉染，并在轉染1 h 前進行換液。將4 μL 轉染試劑VigoFect 與196 μL NaCl 混合后靜置5 min。隨后將10 μg 的Flag-HPIP 與NaCl 混勻，使其總量為200 μL。再將上述兩種混合液混勻共計400 μL，室溫靜置15 min，加入6 cm 培養皿中。同樣方法轉染Flag 空載體作為對照。轉染后4~6 h 后換液，24~48 h 后收集細胞。

6 Western blot 實驗將細胞收集于EP管中，3 000 r/min 狀態下離心5 min，吸棄上清，加入2~3倍RIPA 裂解液后冰浴30 min，隨后加入等量的2×SDS 緩沖液，用沸水煮10 min 后，10 000×g 離心2 min。將所得樣品進行聚丙烯酰胺凝膠電泳；隨后用半干轉膜儀在16 V、1.5 h 條件下將蛋白轉至硝酸纖維素膜。5%脫脂奶粉封閉1 h，孵育抗Flag-HRP 抗體(1∶1 000 稀釋)1 h。TBST 緩沖液洗膜3 次，5 min/次。最后采用ECL 化學發光法進行顯影。

7 CCK-8 法 將pcDNA3.0-Flag-HPIP 和pcDNA 3.0-Flag 空載體分別轉染于A549 細胞培養24 h，胰酶消化細胞，使用完全培養基制備細胞懸液，于96 孔板每孔接種200 μL 細胞懸液(細胞密度3 000/孔)，過表達HPIP 組和對照組均設置3 個復孔，置于37℃培養箱中培養。細胞貼壁后，分別在培養0 h、24 h、48 h、72 h、96 h 時取出96孔板，吸去培養基，每孔加入100 μL 稀釋后的CCK-8 反應液(CCK-8 與培養基按1∶10 進行稀釋)。37℃下繼續培養1 h 后，酶標儀檢測450 nm 處的光密度值，繪制生長曲線。

8 克隆形成實驗將轉染后的A549 細 胞 以3 000/孔的細胞密度接種于6 孔板中，過表達HPIP 組和對照組分別設置3 個復孔。培養2 周后，吸棄培養基，PBS 清洗后，使用4%多聚甲醛固定，0.5%結晶紫染色30 min，拍照后使用Image J 軟件進行克隆計數。

9 劃痕實驗 將肺癌A549 細胞接種于6 孔板，進行細胞轉染。待細胞密度達到80%后，用滅菌的200 μL 槍頭進行劃痕。PBS 緩沖液輕柔沖洗3 次，以去除漂浮的細胞，并加入無血清培養基，顯微鏡下拍照記錄劃痕變化情況。繼續培養18 h后在相同部位進行拍照，使用Image J 軟件分析劃痕寬度。

10 統計學分析 采用SPSS25.0 和GraphPad Prism 8軟件進行統計學分析，實驗結果以±s表示。兩組間采用t檢驗進行比較，多組間采用方差分析進行比較。P＜0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1 HPIP 基因編碼序列的擴增 以人乳腺文庫作為模板進行HPIP 編碼序列的擴增，在上述反應條件下得到PCR 產物，瓊脂糖凝膠電泳結果顯示所得條帶位置約在2 109 bp，且無其他條帶，符合HPIP 編碼序列的預期大小。見圖1。

圖 1 目的基因HPIP 的PCR 擴增產物(M：BM 15 000 DNA 標志物；1：PCR 擴增產物)Fig.1 PCR amplification products of the target gene HPIP (M: BM 15 000 DNA marker; 1: PCR amplification products)

2 重組質粒pcDNA3.0-Flag-HPIP 的構建和測序鑒定 PCR 擴增后的HPIP 片段和pcDNA3.0-Flag載體用Hind Ⅲ和EcoR Ⅴ進行雙酶切，經連接、轉化入DH5α 感受態細胞，挑取克隆后進行菌液PCR 鑒定(圖2)。提取質粒，瓊脂糖凝膠電泳進行雙酶切鑒定(圖3)，在2 109 bp 處可見一條特異性目的條帶，而對照組相應位置無條帶，提示HPIP 編碼序列與pcDNA3.0-Flag 載體連接成功。后將所得質粒進行測序，結果顯示目的基因序列無位點突變，符合預期結果。

圖 2 pcDNA3.0-Flag-HPIP 的菌液PCR 鑒定結果[M：BM 15 000 DNA 標志物；1 ~ 4：挑取的不同菌落；N：陰性對照(以雙蒸水為模板)；P：陽性對照(以乳腺文庫為模板)]Fig.2 PCR identification of pcDNA3.0-Flag-HPIP (M: BM 15 000 DNA marker; 1 - 4: different colonies picked up; N: negative control [double distilled water as template]; P: positive control[human breast library as template])

圖 3 pcDNA3.0-Flag-HPIP 雙酶切產物鑒定(M：BM 15 000 DNA標志物；1：pcDNA3.0-Flag-HPIP 重組質粒；2：空載體)Fig.3 Identification of pcDNA3.0-Flag-HPIP double enzyme digestion product (M: BM 15 000 DNA marker; 1: recombinant plasmid of pcDNA3.0-Flag-HPIP; 2: empty vector)

3 Western blot 驗證pcDNA3.0-Flag-HPIP 的蛋白表達 重組質粒pcDNA3.0-Flag-HPIP 和pcDNA3.0-Flag 空載體分別轉染肺癌A549 細胞系，24 h 后收集蛋白進行SDS-PAGE 凝膠電泳，使用抗Flag-HRP 抗體檢測蛋白表達。結果顯示，與對照組相比，轉染Flag-HPIP 組在Flag-HPIP 蛋白位置(約81 kU)處檢測到明顯特異性條帶。見圖4。

4 CCK-8 法驗證Flag-HPIP 促進A549 細胞的生長 肺癌A549 細胞株轉染Flag-HPIP 或Flag 空載體后，檢測肺癌細胞增殖能力的變化。CCK-8 實驗結果顯示，轉染Flag-HPIP 組和轉染Flag 空載體組第4 天的細胞光密度平均值分別為1.222±0.063 和0.919±0.053，提示Flag-HPIP 可促進A549細胞的生長(t=6.382，P＜0.05)。見圖5。

5 克隆形成實驗驗證Flag-HPIP 促進A549 細胞的增殖 肺癌A549 細胞株分別轉染Flag-HPIP 或Flag 空載體后，以3 000/孔的細胞密度鋪于6 孔板。結果顯示，過表達HPIP 后肺癌細胞形成的克隆數明顯增多，差異有統計學意義(t=7.308，P＜0.01)。見圖6。

6 劃痕實驗驗證Flag-HPIP 促進A549 細胞的遷移能力 采用劃痕實驗檢測肺癌細胞的遷移能力。結果顯示，與對照組相比，轉染Flag-HPIP組A549 細胞的平均遷移距離顯著增加(t=5.482，P＜0.01)，提示HPIP 可增強肺癌A549 細胞的遷移能力。見圖7。

圖 4 Western blot 檢測pcDNA3.0-Flag-HPIP 融合蛋白表達(1：pcDNA3.0-Flag 空載體；2：重組質粒pcDNA3.0-Flag-HPIP)Fig.4 Expression of pcDNA3.0-Flag-HPIP fusion protein detected by western blot (1: empty vector; 2: pcDNA3.0-Flag-HPIP)

圖 5 CCK-8 實驗檢測Flag-HPIP 對A549 細胞的增殖能力影響(aP<0.05，vs 空載體)Fig.5 CCK-8 assay was used to detect the proliferation ability of Flag-HPIP on A549 cell line (aP<0.05, vs empty vector)

圖 6 克隆形成實驗檢測肺癌A549 細胞的增殖能力 A：肉眼觀察；B：統計定量結果Fig.6 Proliferation ability of lung cancer A549 cell line by clone formation assay A: naked-eye observation; B: quantitative results of the clone formation assay

圖 7 劃痕實驗檢測肺癌A549 細胞的遷移能力 A：劃痕實驗鏡下觀察(40×，比例尺：10 μm)；B：劃痕實驗定量結果Fig.7 Migration ability of lung cancer A549 cell line detected by wound healing assay A: observation under the microscope of the wound healing assay (40×, scale bar: 10 μm); B: quantitative results of the wound healing assay

討 論

HPIP 基因位于1 號染色體的長臂，編碼731個氨基酸的蛋白質，主要定位于細胞骨架纖維，同時具備在細胞核與細胞質之間穿梭的能力[5]。HPIP 最早被發現表達于早期造血前體細胞中，參與器官形成和腫瘤發生。目前人們對HPIP 生物學功能的認識仍比較有限。

近年來，越來越多的證據表明HPIP 參與腫瘤進展的調控，提示HPIP 有望成為惡性腫瘤的分子標志物或潛在治療靶點[11-16]。Jiang 等[13]發現細胞應激反應元件1(cellular stress response 1，CSR1)在肝癌中異常低表達，過表達CSR1 通過抑制HPIP 來抑制肝癌細胞的增殖和轉移。Bugide 等[17]報道HPIP 在高級別卵巢癌中高表達，可通過抑制凋亡和激活細胞周期進程進而促進卵巢癌OAW42 細胞的生長，并通過激活PI3K/AKT 信號通路促進OAW42 細胞的遷移、侵襲和上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)。Sayeeram等[18]通過生物信息學分析篩選驗證了HPIP 在肺腺癌中表達高度上調，并且與肺腺癌患者的低生存率相關，為肺癌的早期檢測和診斷提供了潛在生物標志物。EMT 對肺癌細胞的遷移和侵襲有重要作用，而TGF-β 信號通路可顯著誘導EMT 促進肺腺癌侵襲和轉移[19]。Shi 等[6]發現在肺癌A549細胞中，可通過沉默HPIP 減弱Smad2 的磷酸化，進而抑制TGF-β1 誘導的EMT 過程，提示HPIP有成為肺癌治療新靶標的潛力。

另外，研究發現HPIP 與骨關節炎、腎纖維化等多種疾病的發展密切相關[20-22]。HPIP 在骨關節炎軟骨中表達升高，并促進軟骨細胞增殖，提示HPIP 可能是治療骨關節炎的重要基因[20]。可見HPIP廣泛參與了機體多種生理病理過程的調控。

本研究構建了帶有Flag 標簽的HPIP 真核表達載體，并將重組質粒轉染至肺癌細胞進行蛋白表達鑒定，結合測序結果證實重組質粒構建成功。隨后驗證了HPIP 對肺癌A549 細胞增殖和遷移能力的影響。結果表明，與對照組相比，pcDNA3.0-Flag-HPIP 可促進A549 細胞的增殖和遷移能力，初步驗證了其在肺癌細胞中的功能表型。但本研究僅圍繞細胞實驗展開，缺乏組織標本和實驗動物的表型驗證，同時尚未進行深入的機制挖掘，HPIP 對肺癌增殖轉移的信號通路機制仍有待深入研究。