小鼠單側腎缺血再灌注缺血時間與急性腎損傷發(fā)生的關系研究

陳健文，王 雷，李懷康，焦啟龍，袁 清，黃 燕，李修彬，徐俊楠，王晨峰，王保軍，馬 鑫

1 解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學中心 泌尿外科，北京 100853；2 解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學中心 腎臟病科，解放軍腎臟病研究所，腎臟疾病國家重點實驗室，國家慢性腎病臨床醫(yī)學研究中心，腎臟疾病研究北京市重點實驗室，北京 100853

急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)常見原因包括缺血再灌注損傷(ischemia reperfusion injury，IRI)、敗血癥及腎毒性物質損傷，其中缺血再灌注導致的AKI 一直是腎病領域經(jīng)久不衰的研究熱點與難點[1-2]。在泌尿外科領域，行保留腎單位腎部分切除術(nephron sparing surgery，NSS)時需夾閉腎動脈以控制手術失血量，這樣有助于腫瘤切除和創(chuàng)面縫合，然而夾閉腎動脈會引起暫時性腎缺血和潛在腎損傷。目前臨床普遍認可腎熱缺血25 min 為造成AKI 的界限[3]。也有研究表明，腹腔鏡腎部分切除術熱缺血時間超過20 min 和術前腎小球濾過率與術后腎小球濾過率較差相關，腹腔鏡腎部分切除術熱缺血時間每延長9 min，術后并發(fā)癥發(fā)生率增加2.54 倍[4]。然而這些文獻的結論缺乏大樣本臨床數(shù)據(jù)支撐，且腎缺血時間與AKI 的具體關系也缺乏明確的基礎研究證據(jù)。鑒于小鼠較強的可控性、個體間的均一性以及前期術者對小鼠缺血再灌注手術做了大量探索，穩(wěn)定性與成熟度較好，我們選擇小鼠作為動物模型，通過設置不同的缺血時間，系統(tǒng)性地檢測各組術后一系列指標的變化，探究小鼠缺血再灌注致AKI 模型中不同缺血時間對AKI 發(fā)生的影響，為泌尿外科腎部分切除術缺血時間對腎損害發(fā)生的影響提供基礎研究證據(jù)，并為AKI 研究提供缺血時間的依據(jù)與新思路。

材料與方法

1 動物及分組 成年雄性C57BL/6 小鼠15 只，體質量20~22 g，購于解放軍總醫(yī)院醫(yī)學實驗動物中心，動物實驗獲得解放軍總醫(yī)院動物倫理委員會的批準。標準嚙齒類飼料飼養(yǎng)，自然光暗周期，室溫25℃左右，濕度50%左右，每籠3 只，自由進食水。15 只小鼠按照不同缺血時間(0 min、15 min、25 min、30 min、45 min)隨機分為5 組，每組3 只。

2 IRI 手術 按照各組的缺血時間，行左側腎IRI+右側腎切除手術。小鼠稱重，待麻醉生效后雙側側腹部備皮，碘伏消毒手術區(qū)域(上至肩胛下，下至尾巴根部)。將小鼠俯臥，置于37℃~38℃恒溫工作臺。先從右側側腹部開口，分離并結扎右側腎蒂，切除右側腎，記錄切除腎用時，去包膜擦干血漬后稱重。再夾閉左側腎蒂：左側側腹部距離脊柱1.5 cm 處縱行切1~2 cm 小口，逐層切開皮膚和側腹部肌肉，暴露腎，分離腎蒂，暴露腎動脈和靜脈，將無損傷動脈夾夾閉腎動脈和靜脈。觀察腎顏色逐漸變成紫褐色，回納腎入腹腔，記錄左腎處理時間，記錄夾閉開始時間。將小鼠放置于恒溫工作臺保持體溫，腎溫度恒定在37℃~38℃，用紗布蓋住保暖。不同缺血時間后，松開無損傷動脈夾，可見腎數(shù)秒內(nèi)轉為淡紅色。0.9%氯化鈉注射液500 μL 經(jīng)傷口注入腹腔，防止術后脫水。3 個0 絲線縫合腹壁和肌肉。缺血0 h 為假手術組(Sham 組)不進行左腎夾閉處理，余操作同其他組。

3 小鼠標本取材及腎功能檢測 術后密切觀察并記錄小鼠一般狀態(tài)，術后24 h 記錄體質量。麻醉后腹部備皮，碘伏消毒手術區(qū)域。1 mL 無菌注射器扎入下腔靜脈取血600~800 μL，放入3 mL裝的黃帽惰性分離膠促凝管。室溫靜置1 h 后，4 000 r/min 離心10 min。取上清，50 μL 加入150 μL去離子水稀釋4 倍，送解放軍總醫(yī)院生化科檢測血清肌酐、尿素氮。從下極小心分離腎包膜，取出左側腎，放置于福爾馬林內(nèi)，用于行PAS 染色。

4 腎病理學檢測及腎小管損傷評分 將1/4 的腎經(jīng)福爾馬林固定、脫水、石蠟包埋處理，組織切片后行PAS 染色。隨機選取10 個400 倍鏡下的非重疊視野，腎皮質區(qū)5 張、皮質-髓質交界區(qū)5 張，采用盲法對切片進行急性腎小管壞死(acute tubular necrosis，ATN)評分，評判刷狀緣消失、腎小管擴張、管型形成、腎小管壞死和中性粒細胞浸潤等占腎小管總數(shù)的百分比。最終ATN 得分情況如下：0 分，正常；1 分，輕度損傷(1%~10%受累)；2 分，中度損傷(11%~ 25%受累)；3 分，重度損傷(26%~45%受累)；4 分，高度嚴重損傷(46%~75%受累)；5 分，廣泛損傷(＞76%受累)[5]。

5 統(tǒng)計學方法 采用GraphPad Prism 7 統(tǒng)計學分析，輔助以Adobe Illustrator 和Photoshop 軟件作圖。計量資料以±s表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗或單因素方差分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 手術情況 15 只小鼠均順利完成手術，缺血0 min、15 min、25 min、30 min、45 min 組小鼠從切開右側背側皮膚到結扎右腎腎蒂再到取下健側右腎用時分別為(118.7±5.5)s、(122.3±6.1)s、(118.7±4.9)s、(122.7±4.9)s、(123.7±8.1)s，組間比較無統(tǒng)計學差異(P＞0.05，圖1A)；從切開左側背部皮膚到左側腎蒂夾閉，用時分別為(61.7±3.5)s、(55.7±7.8)s、(58.3±4.0)s、(61.0±2.6)s、(56.3±8.3)s，組間比較無統(tǒng)計學差異(P＞0.05，圖1B)。各組小鼠術前體質量組間比較無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)；術前右腎重量與體質量比值分別為(5.73±0.01)‰、(5.90±0.19)‰、(5.70±0.44)‰、(5.80±0.01)‰、(5.97±0.15)‰，組間比較無統(tǒng)計學差異(P＞0.05，圖2)；手術夾閉左側腎蒂1~2 min 內(nèi)，腎從粉紅色逐漸變?yōu)樽虾稚砷_阻斷5~10 s 內(nèi)腎從紫褐色恢復為淡紅色。

圖 1 缺血再灌注手術用時比較(ns：P＞0.05，vs 0 min 組)A：從切開右側背側皮膚到取下健側右腎用時比較；B：從切開左側背部皮膚到左側腎蒂夾閉操作用時比較Fig.1 Comparison of ischemia-reperfusion operation time (ns:P＞0.05, vs 0 min group)A: time from the right dorsal skin incision to the removal of the healthy right kidney; B: comparison of operation time from left dorsal skin incision to left renal pedicle clipping

2 術后各組小鼠精神狀態(tài)比較 術后約2 h 小鼠蘇醒，均較為活潑，自由進食水。術后6 h 各組開始出現(xiàn)精神狀態(tài)及活動狀態(tài)的差異。術后24 h 缺血0 min、15 min、25 min 組平均每分鐘活動時間、活動累計距離以及探頭次數(shù)顯著高于缺血30 min、45 min 組，缺血0 min、15 min、25 min組組間無統(tǒng)計學差異。有研究表明AKI 誘發(fā)消化道出血，術后24 h 取材，切開腹部皮膚，可見缺血0 min、15 min、25 min 組小鼠腹腔腸道顏色正常(圖3A)，蠕動正常，而缺血30 min、45 min 組小鼠小腸多個區(qū)域變灰黑色(圖3B)，蠕動減弱。

3 術后各組腎重量指標比較 各組小鼠術后24 h體質量均低于術前(圖4A)，缺血30 min、45 min組體質量下降程度明顯高于缺血0 min 組(P＜0.001)，缺血15 min、25 min、0 min 組組間以及

圖 3 術后24 h 腹腔腸道情況比較A：未發(fā)生AKI 組小鼠腹腔腸道顏色正常；B：發(fā)生AKI 組小鼠小腸多個區(qū)域變灰黑色(橢圓形圈出)Fig.3 Comparison of intestinal conditions at 24 h after surgeryA: mice without AKI had normal abdominal bowel color;B: multiple areas of the small intestine of mice with AKI became gray and black (oval circled)

缺血30 min、45 min 組組間無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。各組小鼠左側缺血腎重量較各組術前切除的健側腎重量增加(圖4B)，缺血30 min、45 min組腎重量增加量明顯高于缺血0 min 組(P＜0.01)，缺血0 min、15 min、25 min 組組間以及缺血30 min、45 min 組組間無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。各組小鼠左側缺血腎重量與術后體質量比值(圖4C)，缺血30 min、45 min 組明顯高于缺血0 min 組(P＜0.001)，缺 血0 min、15 min、25 min 組組間以及缺血30 min、45 min 組組間均無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。

圖 4 術后24 h 左側腎重量及術后體質量變化(aP＜0.01, bP＜0.001，vs 0 min 組)A：術后體質量變化；B：術后腎重量變化；C：術后腎重量與體質量比值情況Fig.4 Changes of left kidney weight and body weight at 24 h after surgery (aP＜0.01, bP＜0.001, vs 0 min group)A: postoperative weight change; B: postoperative renal weight change; C: ratio of postoperative kidney weight to body weight

4 術后各組腎功能指標比較缺血30 min、45 min 組術后血清肌酐(圖5A)、術后血清尿素氮(圖5B)等均明顯高于缺血0 min、15 min、25 min組(P＜0.05)，缺血0 min、15 min、25 min 組組間以及缺血30 min、45 min 組組間的上述指標均無明顯差異。

5 術后各組腎病理及損傷評分比較 病理切片PAS 染色可見缺血0 min、15 min 組小鼠腎皮質及髓質結構正常，腎小管刷狀緣無脫落(圖6)。缺血25 min 腎皮髓交界處零星出現(xiàn)被壞死細胞堵塞的腎小管。缺血30 min 可見腎皮質區(qū)，近端小管出現(xiàn)大量脫落的腎小管上皮細胞或脫落的刷狀緣，腎皮髓交界處可見大量被壞死細胞堵塞的腎小管。缺血45 min 皮質區(qū)除了有脫落的腎小管上皮細胞或脫落的刷狀緣，還可見片狀蛋白管型，皮髓交界處也有大量被壞死細胞堵塞的腎小管。缺血30 min、45 min 組術后病理急性腎小管損傷評分明顯高于缺血0 min、15 min、25 min 組(P＜0.05，圖7)，缺血0 min、15 min、25 min 組組間無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)，缺血30 min、45 min 組組間無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。

圖 5 術后24 h 血清肌酐尿素氮(G1：缺血0 min 組；G2：缺血15 min 組；G3：缺血25 min 組；G4：缺血30 min 組；G5：缺血45 min 組)A：血清肌酐；B：血清尿素氮Fig.5 Serum creatinine and blood urea nitrogen at 24 h after surgery(G1: 0 min ischemia group; G2: 15 min ischemia group; G3:25 min ischemia group; G4: 30 min ischemia group; G5:45 min ischemia group)A: serum creatinine; B: blood urea nitrogen

圖 6 小鼠單側腎缺血再灌注急性腎損傷模型缺血時間各組術后24 h 病理PAS 染色(40×. 黑色箭頭為正常腎小管刷狀緣，綠色箭頭標注為脫落的腎小管上皮細胞或脫落的刷狀緣，＊號標注為被壞死細胞堵塞的腎小管，#號標注為缺血45 min 組皮質區(qū)小管蛋白管型。標尺均為40 μm)Fig.6 PAS stain at 24 h after operation in unilateral renal ischemiareperfusion acute kidney injury model of mice in different groups (40×. Black arrows indicate normal renal tubule brush-like margin, green arrows indicate exfoliated renal tubule epithelial cells or exfoliated brush border, ＊ indicate renal tubules blocked by necrotic cells, and # indicate protein cast in cortical area of 45 min ischemia group. All scales were 40 μm)

圖 7 急性腎小管壞死評分(G1：缺血0 min 組；G2：缺血15 min組；G3：缺血25 min 組；G4：缺血30 min 組；G5：缺血45 min 組)Fig.7 Acute tubular necrosis scores (G1: 0 min ischemia group;G2: 15 min ischemia group; G3: 25 min ischemia group; G4:30 min ischemia group; G5: 45 min ischemia group)

討 論

自1887 年完成第一個計劃中的腎部分切除術開始，經(jīng)歷了一個多世紀后該術式才逐漸成為腎小腫瘤(≤4 cm)的推薦手術[6]。大部分研究都證實對腎小腫瘤進行腎部分切除手術是安全無瘤的，相比于根治性腎切除術，由于NSS 保留了部分正常腎組織，其總生存期較根治性腎切除術(radical nephrectomy，RN)更長[7]。然而，2011 年一項發(fā)表于歐洲泌尿外科雜志的腎部分切除術相關前瞻性隨機對照研究結果表明，保留腎單位的腎部分切除術較腎根治性切除術的總生存期反而下降[8]。這一觀點在學術界產(chǎn)生較大爭議，許多學者認為，該研究存在一定局限性，有待擴大樣本量驗證其結果，并一致支持在確認NSS 的總體生存效果之前，腎小腫瘤仍應以NSS 手術為主[9]。2018 年，Ristau 等[10]研究表明，對于腫瘤≤4 cm的T1a 期腎癌，行NSS 患者總生存期較行RN 患者長，對于腫瘤＞4 cm 的T1b 或T2a 腫瘤，總生存期無統(tǒng)計學差異。2020 年的一項納入23 項研究、涉及30 018 例腎腫瘤患者的Meta 分析發(fā)現(xiàn)NSS 與較低的醫(yī)院死亡率和再手術率相關，而RN 與較少的并發(fā)癥相關[11]。在NSS 領域存在上述分歧，主要與患者的一般狀況及合并癥、腫瘤的部位及大小、術者的經(jīng)驗等有關[6]。目前認為腎小腫瘤手術仍應以NSS 為主。

過去一直認為AKI 是一過性的可逆性損傷，然而大量的臨床及基礎研究證據(jù)表明，AKI 有嚴重的急、慢性后遺癥，10%~50%的AKI 存活患者出院后依舊需要透析治療，約15%的AKI 患者會進展為慢性腎病(chronic kidney disease，CKD)[1,12]。腎部分切除術在阻斷腎動脈的同時，會造成腎缺血再灌注損傷，因此在保存腎實質的基礎上盡量減少熱缺血時間，避免AKI 發(fā)生，或減少AKI 的急、慢性后遺癥，成為NSS 領域重要的臨床問題。

目前臨床普遍認可腎熱缺血25 min 為造成AKI 的時間臨界點[3]，也有研究認為是20 min[4]。梅奧診所泌尿外科的Thompson 等[13]在對362 例進行腎部分切除術的孤立腎患者進行研究分析后發(fā)現(xiàn)，較長的熱缺血時間與短期和長期的腎并發(fā)癥有關，基于此，他們提出在手術過程中腎動脈被阻斷的每一分鐘都非常重要。因此，熱缺血的安全持續(xù)時間仍有爭議，腎缺血時間與AKI 的具體關系還需更大樣本量及明確的基礎研究證據(jù)。

小鼠IRI 手術可以很好地模擬人腎部分切除術的腎動脈阻斷造成的腎損傷，文獻報道IRI 模型手術方法多種多樣，有雙側IRI(bIRI)、保留對側腎+單側IRI(uIRI)、對側腎切除+單側IRI(uIRIx)、單側IRI+對側術前14 d 切除等[14-21]。IRI 的缺血時間也各不相同，從缺血18 min 至缺血35 min。有報道單側腎IRI+對側腎切除(uIRIx)模型缺血大于18 min、bIRI 模型缺血大于21 min，小鼠在72 h內(nèi)均死亡[19]，也有報道雙側缺血21 min、26 min、28 min、30 min、35 min，小鼠能存活至少7 d[14,22-25]。結合既往學者經(jīng)驗，我們采用對側腎切除+單側IRI(uIRIx)術式，設置缺血0 min、15 min、25 min、30 min、45 min 五個分組，試圖解決前面提到的NSS 關鍵臨床問題。

本研究發(fā)現(xiàn)，小鼠在37℃~38℃情況下，腎缺血25 min 以內(nèi)不發(fā)生AKI，而缺血30 min 以上發(fā)生AKI。這表明在體溫環(huán)境下，腎缺血存在一個很窄的窗口(25~30 min)，我們將這一窗口稱為“缺血臨界點”。在這個臨界點前后，腎損傷將會陡然增加，出現(xiàn) “劇變”。也有學者發(fā)現(xiàn)AKI 有一個缺血時間界限，認為單側腎IRI+對側腎切除(uIRIx)模型為18 min，bIRI 模型為21 min[19]。上述報道的時間與本研究結果不一致，可能與手術方式、手術條件、小鼠基因背景等因素有關。

本研究中缺血30 min 及45 min 組小鼠發(fā)生了AKI，術后第1 天主要表現(xiàn)為體質量減輕、精神狀態(tài)變差、活動減少、腎體積增加、缺血左腎與術后體質量比值增加，這與臨床AKI 患者表現(xiàn)一致。臨床上AKI 患者常出現(xiàn)尿量減少、氮質血癥、水電解質平衡紊亂、代謝性酸中毒、消化系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、血液系統(tǒng)等癥狀[26-27]。本研究中小鼠的AKI 術后病理主要體現(xiàn)為皮質腎小管上皮細胞極性喪失、凋亡、脫落，皮髓交界處大量細胞管型堵塞腎小管。術后24 h，損傷較重的區(qū)域主要在皮髓交界處，后續(xù)的損傷程度變化需要更多時間點來驗證。在取材時，發(fā)現(xiàn)缺血30 min、45 min 組小鼠的腸道變黑，這可能與AKI 引發(fā)的腸道出血相關，與臨床上觀察到的25%急性腎損傷患者并發(fā)消化道出血一致。出血的可能原因為胃黏膜糜爛或應激性潰瘍，但動物出現(xiàn)這一急性并發(fā)癥的概率更高，這一腎-腸的相關性也值得后續(xù)研究。

本研究也存在一些不足：1)需要再完善更多的缺血時間點，在25~30 min 間增加更多分組；2)只觀測了術后24 h 這一個再灌注時間點，后期可以增加檢測時間點，如術后超早期(2 h、6 h)、早期(2 d、3 d)、恢復期(7 d、10 d)、遠期(14 d、28 d)和超遠期(3 個月、6 個月)；3)樣本量較少，應擴大樣本量以得到更加穩(wěn)健的結果；4)檢測手段可以增加，如增加損傷、凋亡等指標的免疫熒光檢測，腎小球濾過率的檢測，尿液收集等。

綜上所述，本研究結果表明小鼠單側腎缺血再灌注AKI 模型存在較窄的誘發(fā)缺血時間窗口。在37℃~38℃溫缺血情況下，單側腎缺血再灌注損傷導致AKI 的缺血時間臨界點在25~30 min，小于25 min 時不導致AKI 發(fā)生，超過30 min 時AKI 發(fā)生。本研究為泌尿外科腎部分切除術缺血時間對腎損傷發(fā)生的影響提供了基礎研究證據(jù)，也為IRI 導致的AKI 研究提供了新思路。