新型冠狀病毒肺炎患者特異性IgG 和IgM 的動態變化分析

郭 樺，馬 琳，王 釗，劉長鑫，張 侃，丁俊諭，王 博，趙慧珺，宋曼雅，管希周

1 解放軍醫學院，北京 100853；2 解放軍總醫院第八醫學中心 呼吸與危重癥醫學部，北京 100091

新型冠狀病毒(2019 novel coronavirus，2019-nCoV)是已知的第7 種可以感染人類的冠狀病毒，與嚴重急性呼吸綜合征病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARS-nCoV)和中東呼吸綜合征冠狀病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus，MERS-CoV)相似，但2019-nCoV 的傳播速度遠比MERS-nCoV 和SARS-nCoV迅速[1]。通過對患者臨床資料分析表明，大多數患者的胸部CT 具有磨玻璃或斑片狀陰影，輕癥患者的臨床表現與其他病毒性肺炎類似，均以咳嗽和發熱為主[2-3]。此外，患者普遍存在外周血淋巴細胞明顯減少、血小板減少、C 反應蛋白升高的現象[4]。因此，從輕度流感樣癥狀到呼吸衰竭，新型冠狀病毒肺炎(corona virus disease 2019，COVID-19)的臨床表現和實驗室特征很難被用于鑒別診斷。反轉錄聚合酶鏈反應(reverse transcription PCR，RTPCR)和高通量測序技術是COVID-19 確診的金標準，與血清抗體檢測相比，核酸檢測受到樣本采集部位、采集時間的影響，其敏感度為79%，而高通量測序技術成本較高[5]。此外，兩者都是定性診斷，不能幫助判斷病情程度和預后。而抗體是新型冠狀病毒感染后宿主免疫反應的重要組成部分，對疾病診斷與轉歸的有重要價值。本研究采用化學發光免疫分析法對1 921 例COVID-19 患者住院期間特異性血清抗體進行檢測，分析抗體水平動態變化規律及其與疾病嚴重程度的關系。

資料與方法

1 資料來源 對武漢市火神山醫院2020 年2 月2 日-2020 年4 月15 日收治的1 921 例COVID-19患者進行了回顧性分析。納入標準：核酸檢測陽性確診為COVID-19 患者，檢測過血清抗體；排除標準：年齡＜18 歲，入院時間距離發病時間＞3 個月，相關資料不全。

2 分組 以COVID-19 患者核酸檢測陽性第1 天計為發病。根據《新型冠狀病毒肺炎診療方案》，將COVID-19 患者分為輕型、普通型、重型、危重型。輕型：臨床癥狀輕微，影像學未見肺炎表現。普通型：具有發熱、呼吸道等癥狀，影像學可見肺炎表現。重型：符合下列任何一條：出現氣促，呼吸頻率≥30 次/min；靜息狀態下，指氧飽和度≤93%；動脈血氧分壓(PaO2)/吸氧濃度(FiO2)≤300 mmHg (1 mmHg=0.133 kPa)；肺部影像學顯示24~48 h 內病灶明顯進展＞50%者。危重型：出現呼吸衰竭，且需要機械通氣；出現休克；合并其他器官衰竭需ICU 監護治療。1 921 例患者被分為普通組(n=1 280)、重癥組(n=591)和危重組(n=50)，其中普通組包括輕型、普通型患者。

3 核酸與抗體檢測方法 采用實時熒光RT-PCR方法檢測2019-nCoV 核酸，新型冠狀病毒2 個靶標(ORF1ab、N)實時熒光RT-PCR 檢測結果均為陽性。如果出現單個靶標陽性的檢測結果，則需要重新采樣檢測，若仍然為單靶標陽性，判定為陽性。采集患者在院期間病程內的血清樣本進行特異性IgM 和IgG 檢測。血清2019-nCoV 特異性IgM 和IgG 檢測采用中國食品藥品監督管理局批準的重慶生物科學有限公司(IgM：C86095M，IgG：C86095G)的化學發光試劑盒。血清標本在56℃保存30 min。IgM 和IgG 檢測采用間接化學發光法。經過兩次孵化-洗滌循環，加入激發溶液后獲得最終讀數。IgM 和IgG 的檢測閾值均為10 AU/mL，樣品濃度為≥10.00 AU/mL 時為陽性，否則為陰性。

4 分析指標 1)比較普通組、重癥組、危重組患者的一般臨床資料，包括患者年齡、性別、臨床表現、合并癥等；2)比較三組患者的實驗室指標，如中性粒細胞計數、白細胞計數、降鈣素原等；3)比較三組患者在病程中抗體陽性率與滴度值等。

5 統計學分析使用EXCEL2016 進行數據匯總，使用SPSS23.0 進行研究資料分析。研究資料中的計量數據，均先行正態性檢驗。正態計量資料以±s表示。多組間的比較為單因素方差分析(統計量為F)+兩兩比較LSD-t檢驗(統計量為LSD-t)。偏態資料以Md(IQR)描述，多組比較為Kruskal-Wallis 秩檢驗(統計量為Hc)。計數資料以例數及率描述，多組間比較為整體+分割卡方檢驗(統計量χ2)。統計檢驗水準α=0.05，均為雙側檢驗。

結 果

1 三組患者的臨床特征比較 納入的全部患者中50.4%為女性，危重組中男性(64.0%)明顯多于女性 (36.0%)。危重組年齡高于普通組和重癥組。高血壓(24.8%)是本組患者最常見的基礎疾病，其次是糖尿病(12.0%)。發熱和咳嗽是COVID-19 患者最常見的癥狀。死亡22 例(1.1%)均在危重組，危重患者的住院時間明顯長于其他兩組。三組在核酸轉陰時間上相近。見表1。

表 1 三組COVID-19 患者臨床資料比較(n,%)Tab. 1 Comparison of baseline data between the three groups (n,%)

2 三組實驗室指標比較 隨著病情嚴重程度的增加，中性粒細胞計數、白細胞計數以及降鈣素原、天冬氨酸轉移酶、尿素氮、肌酸激酶同工酶的濃度均顯著升高。以0.4×109/L 為界值時，危重組淋巴細胞減少的人數明顯高于其他兩組(P＜0.001)。此外，危重患者的白蛋白和肌酸激酶水平在三組患者中最低(P＜0.001)，C 反應蛋白、白細胞介素-6 (interleukin-6，IL-6)和乳酸脫氫酶濃度明顯高于重癥組和普通組。見表2。

3 新冠肺炎患者抗體變化趨勢 由于每例患者核酸檢測陽性時間不同，住院時間長短不一，因此并非每例患者采集到相同數目的血清樣本，共獲得IgM 樣本3 071 份、IgG 樣本3 027 份。我們觀察到IgM 和IgG 抗體陽性在發病后第1 天即可檢測到，發病后第1 周IgM 和IgG 陽性率分別為52.2%和74.6%，IgM 陽性率在發病后第6 周達到高峰(80.9%)，之后呈下降趨勢；IgG 陽性率在第4 周達到90.69%，第9 周達到100%，且一直維持在較高水平(圖1)。IgG 滴度值[146.98(77.48，182.46)]在發病后30 d 左右達到高峰，IgM 滴度值[30.88(9.50，72.69)]在發病后40 d 左右達到高峰(圖2)。

圖 1 新冠肺炎患者IgM 和IgG 抗體陽性率變化趨勢Fig.1 Trend of positive rate of IgM and IgG antibodies

圖 2 新冠肺炎患者IgM 和IgG 滴度值變化趨勢Fig.2 Trend of titer values of IgM and IgG

4 三組患者IgG、IgM 滴度水平變化比較 危重患者IgM 陽性出現時間晚于另兩組，但滴度水平在初期明顯高于其他組，之后呈持續下降趨勢。另兩組IgM 均呈先升后降低的趨勢。危重組IgG 陽性出現最晚，平均滴度明顯低于其他兩組，三組IgG 均呈持續上升趨勢。見表3。

表 2 三組COVID-19 患者實驗室指標比較[Md(IQR)]Tab. 2 Comparison of laboratory results between the three groups (Md[IQR])

表 3 COVID-19 患者抗體滴度的動態變化比較Tab. 3 Dynamic changes of antibodies in the three groups

討 論

在本研究中，我們發現危重組年齡65 歲以上的患者比例較高，死亡患者均在危重組。此外，隨著病情嚴重程度的增加，中性粒細胞計數、白細胞計數以及降鈣素原、天冬氨酸轉移酶、尿素氮、肌酸激酶同工酶的濃度均顯著升高，危重組淋巴細胞減少的人數明顯高于其他兩組(P＜0.001)，其白蛋白和肌酸激酶水平在三組患者中最低(P＜0.001)，C 反應蛋白、IL-6 和乳酸脫氫酶濃度明顯高于重癥組和普通組。我們還觀察到患者血清抗體的總體趨勢為IgM 先升后降，而IgG 為持續上升后保持穩定。危重患者IgM 陽性出現時間最晚，但其滴度水平明顯高于其他兩組，之后呈持續下降趨勢，與其余兩組不同；危重組IgG 出現最晚，平均滴度明顯低于其他兩組。三組間抗體陽性率差異無統計學意義。三組間核酸轉陰時間差異無統計學意義。

多數患者在感染后出現典型的抗體應答，患者的血清抗體變化趨勢與以往研究結果相似。Zhao 等[6]研究顯示，患者的抗體在發病第15 天后迅速升高，抗體診斷的敏感度從發病第8 天開始超過核酸檢測。在我們的結果中，特異性IgM 較早出現，有助于篩查患者。黃亞蘭等[7]認為高水平的IgG 對病毒清除有一定的積極作用，另一項研究報道恢復期的IgG 呈下降趨勢[8]。本研究發現三組患者每周的抗體陽性率和核酸轉陰時間差異均無統計學意義。因此，IgG 提供的保護作用與疾病轉歸之間的關系有待進一步研究。

臨床特征和實驗室結果分析表明，普通組與危重組的65 歲及以上患者比例有明顯差異。危重患者出現中性粒細胞減少和淋巴細胞減少的程度與人數較高，IL-6、C 反應蛋白、降鈣素原也高于其他兩組。有研究認為中性粒細胞/淋巴細胞比值的動態變化可以預測COVID-19 患者的臨床分型、進展和預后[9]。另有一些研究表明，IL-6 和C 反應蛋白的水平較高預示著患者預后不良[10-11]。結合本研究結果，提示中性粒細胞減少、淋巴細胞減少、IL-6 和C 反應蛋白與疾病嚴重程度相關。危重組患者早期IgM 水平明顯高于其他兩組，且免疫反應延遲。有研究報道血清IgM 水平升高意味著患者預后較差，IgM 滴度偏高也與急性呼吸窘迫綜合征和感染性休克的高發病率相關[12-13]。我們認為2019-nCoV 在危重患者中觸發了延遲但強烈的IgM 反應。文獻報道免疫衰老現象，即先天免疫和獲得性免疫功能隨著年齡的增長而改變。因此，年輕人在感染新型冠狀病毒時更有可能是輕癥患者，因為他們易于通過有效的先天免疫反應清除病毒，而老年人對新抗原的反應能力較差，更可能發生細胞因子風暴[14]。此外，年輕人比老年人更容易激活獲得性免疫，獲得性免疫反應延遲與較高的促炎因子之間的不匹配可能解釋了老年患者預后較差[15-16]。

在三組患者抗體表達變化上，危重組IgM 呈持續下降趨勢，與其他兩組不同。危重組IgM 中位滴度值最低，重癥組IgM 中位滴度值最高。危重組患者的IgG 延遲現象與IgM 相似，滴度值始終最低。Hou 等[17]研究得出重癥和危重患者的IgM 水平高于普通患者，危重患者的IgG 水平低于普通和重癥患者，作者認為這可能與危重患者的疾病活動性高或免疫抑制有關。在危重患者中，老年患者2019-nCoV 特異性T 細胞的表型和功能特征發生了明顯變化，其激活分化記憶/效應細胞和遷移的功能均弱于年輕患者[18]。這可能是由于危重患者需要收縮先天免疫和獲得性免疫來抵消因細胞因子風暴所致肺部過度病理表現[19-20]。

綜上所述，抗體檢測可以補充核酸檢測用于診斷。高齡的危重患者存在免疫衰老現象，其先天免疫和獲得性免疫受此影響，導致細胞因子風暴和肺部過度病理表現。本研究探討了COVID-19患者可能的免疫機制，進一步加深了對抗體反應與疾病進展之間的理解。此外，受到回顧性研究的限制，缺少更詳細的免疫細胞、炎癥因子的實驗室結果，未能更準確地說明新冠患者的免疫狀態；沒有檢測病毒載量，不能進一步說明免疫狀態與病毒脫落過程的相關變化。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。