兔背部皮下注射法建立增生性瘢痕動物模型

姚 慶，楊 瓊，李 毅，彭 干，郭梁影，蔣邦紅

病理性瘢痕是臨床上的常見病、多發病，發病機制尚未完全明了[1]。增生性瘢痕形成是多種細胞及細胞因子相互作用、調控的結果，而且與細胞外基質代謝異常、缺氧、高自由基、過度脂質過氧化反應、過度炎性反應及免疫有關。因此，良好有效的瘢痕動物模型對進一步研究增生性瘢痕的生物學機制顯得尤為重要。MORRIS等[2]證實在兔耳急性及慢性創面上有明顯的真皮過度增生。李薈元等[3]從1998年起,在兔耳進行建立增生性瘢痕模型研究的基礎上,作了進一步的探索。本文就無水乙醇皮下注射后建立兔增生性瘢痕動物模型的有效性作一探討。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及動物 新西蘭大白兔27只，體質量均為1.5 kg，雌雄不限；注射器(規格為5 mL)，剃毛器，無水乙醇(濃度為99.5%)，15 cm鋼尺。將27只新西蘭大白兔按照注射無水乙醇1、2、3 mL/kg，隨機分為甲、乙、丙3組，每組9只。

1.2 實驗方法 將實驗兔子麻醉后固定于兔臺，用剃毛器將注射部位相應的兔毛剔至長2 mm左右。用注射器將相應劑量的無水乙醇分別注入甲、乙、丙3組兔子背部皮膚真皮層。將所有兔子放在相同且適宜的環境下飼養，連續觀察并記錄注射部位的變化。

1.3 實驗觀察 注射后7、30、90 d觀察創面上皮化時間、瘢痕的色澤、厚度、表面粗糙程度等。選取最優實驗組兔子注射位點區域中穩定增生時期的皮膚組織以及正常兔子皮膚組織，進行HE染色和Ⅰ型膠原。觀察記錄有無類似人增生性瘢痕組織的病理變化。

2 結果

2.1 增生組織形態大體觀察 注射無水乙醇第7天，注射位點肉眼可見，甲組有一直徑為0.5 cm乳白色點狀區域；乙組有一直徑約為1.5 cm的乳白色近圓形區域，邊界與周圍正常皮膚界限清楚，較正常皮膚變厚，質地變硬；丙組有直徑3.5 cm的近圓形乳白色區域，注射區域與周圍正常皮膚分界清楚，紅腫明顯，較正常皮膚明顯變厚，質地變硬(見圖1)。

注射無水乙醇30 d后，甲組注射區皮膚愈合良好，未觀察到明顯的增生組織，質地柔軟，顏色粉紅，較正常組織無明顯厚度變化；乙組皮膚增生變厚，質地變硬，充血腫脹,表皮顏色為絳紫色；丙組上皮已壞死剝脫，見皮下肌肉及脂肪組織(見圖2)。

注射無水乙醇90 d后，甲組注射區域已完全愈合，顏色、厚度、質地與正常皮膚無異；乙組大部分增生組織軟化變扁平,增生組織逐漸退化消失；丙組皮膚增生明顯，皮膚潰爛面積較大，感染率較高，實驗中有3只兔子死亡(見圖3)。

2.2 鏡下觀察

2.2.1 HE染色觀察 人正常皮膚組織上皮由多層細胞緊密排列而成，上皮基底側有纖維結締組織呈乳頭狀突入上皮，膠原纖維豐富，并有少量的皮膚附屬器。兔正常皮膚組織上皮層以及上皮層的角化層較薄，皮膚附屬器較多，且距離表皮較近，膠原纖維豐富(見圖4)。人類增生性瘢痕表皮層明顯增厚，真皮層內膠原蛋白大量增生，纖維細胞數量增多，體積變大。實驗兔子背部增生性組織，鏡下可見創面真皮層中有大量成纖維細胞及排列致密的膠原纖維，纖維細胞增大，周圍有灶性淋巴細胞浸潤，淺層膠原纖維粗大，排列紊亂，皮膚附屬器減少，類似人增生性瘢痕的鏡下表現(見圖5)。

2.2.2 Ⅰ型膠原免疫組織化學染色觀察 兔正常皮膚組織鏡下可見組織內局灶分布的Ⅰ型膠原纖維染成淡黃色，Ⅰ型膠原纖維數量較少。兔背部增生組織鏡下可見Ⅰ型膠原蛋白染成棕黃色，細胞質內可見棕黃色顆粒，Ⅰ型膠原纖維數量明顯增多(見圖6)。

3 討論

傷口愈合過程中，各種原因導致膠原的合成代謝與降解代謝之間的平衡被破壞，即可形成病理性瘢痕。瘢痕從外觀和機體功能方面均可給病人帶來心理和生理上的痛苦，嚴重者會影響病人自信心，使其產生自卑心理[4]。因此，建立良好的瘢痕動物模型是深入研究的基礎，對研究結果的可靠性有重要影響。

但目前對于病理性瘢痕形成的具體發病機制仍不清楚,由于動物與人皮膚結構的差異性,以及類瘢痕樣增生組織來源尚存在爭議等原因,目前尚無公認的比較理想的病理性瘢痕動物模型。建立穩定而有效的動物瘢痕模型成為瘢痕研究領域面臨的重要任務，該模型應符合以下要求：(1)瘢痕體積盡可能大，由于模型建立后要進行瘢痕治療研究，體積越大，越有利于后期的體積變化觀察，且誤差越小，而且能滿足后續多項檢測的需要；(2)穩定時間足夠長，瘢痕的發展及治療是一個長期的過程，短期維持的模型不僅治療效果不明顯，而且治療效果也易與模型退化萎縮相混淆；(3)造模動物無其他特殊要求。考慮到經濟成本，一般選擇清潔級動物、SPF級動物。目前國內一般選用清潔級或SPF級的兔、豚鼠、小鼠、大鼠等作為皮膚瘢痕造模的動物[5-6]。

本研究顯示，乙組中注射區皮膚組織增生明顯，皮膚較厚，表面粗糙，質地較硬，持續時間約為60 d，且死亡率為0。HE染色鏡下，兔背部增生組織的病理變化與人增生性瘢痕的病理變化基本一致；人類瘢痕的病理變化特點之一為Ⅰ型膠原為主的細胞外基質的過度沉積[7]，而本實驗中亦觀察到乙組兔背部增生組織Ⅰ型膠原的數量較正常兔皮膚組織明顯增多。綜上，2 mL/kg無水乙醇注射組為3個實驗組中結果最優的一組，可作為人增生性瘢痕組織動物模型，可一定程度上模擬人增生性瘢痕組織的病理生理特點。

本實驗的優點主要有：(1)與本實驗的造模方法操作簡便，定量明確，容易掌握和重復。(2)兔的背部面積較大，操作空間較大，瘢痕形成穩定，利于進行深入的實驗研究。(3)無水乙醇價格較低，實驗成本低。本實驗也存在一些局限性：(1)瘢痕組織持續時間與人類增生性瘢痕相比較短；(2)與其他實驗動物如小鼠和豚鼠相比，兔子的成本較高。