葡萄白粉病抗性鑒定方法優化及品種抗性評價

賈靜怡 張瑋 燕繼曄 徐海英 孫磊 李興紅

摘要 ：本研究通過對葉盤保濕方法的改進，不同菌源接種后發病嚴重度的分析，抗、感病對照品種的確定，建立了一種更為便捷、可靠、穩定的葡萄白粉病室內抗性鑒定方法：取葡萄藤自上而下第2～4片幼嫩葉片，打取直徑15 mm的葉盤置于1.5%水瓊脂平板進行保濕，采集田間菌源直接制備孢子濃度為2×105個/mL的孢子懸浮液接種，選定抗、感病葡萄品種做對照，14 d即可完成抗性鑒定。采用此方法對11個葡萄品種（品系）進行了葡萄白粉病抗性評價，結果表明：供試的11個品種（品系）對葡萄白粉病的抗性存在明顯差異，其中高感品種為‘巨峰‘夏黑和‘陽光玫瑰等，感病品種為‘玫瑰香和‘馬瑟蘭，抗病品種為‘瑞都科美和‘無核翠寶，高抗品種為‘北冰紅。試驗結果為葡萄抗病品種的選育及利用提供了方法和基礎參考數據。

關鍵詞 ：葡萄白粉病; 品種; 抗性鑒定

中圖分類號： S 436.631.1

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2019630

Optimization of grapevine powdery mildew resistance identification methods and evaluation of variety resistance

JIA Jingyi1，2， ZHANG Wei1， 2， YAN Jiye1， 2， XU Haiying3， SUN Lei3， LI Xinghong1， 2*

（1. Institute of Plant Protection and Environmental Protection，Beijing Academy of Agricultural and Forestry Sciences，

Beijing 100097， China; 2. Beijing Key Laboratory for Environment Friendly Management on Fruit Diseases and Pests in

North China， Beijing 100097， China; 3. Beijing Academy of Forestry and Pomology Sciences， Beijing 100093， China）

Abstract ：Through the improvement of leaf disc moisturization methods， analysis of the severity of disease after inoculation with different strains， and identification of resistant and susceptible varieties， a more convenient， reliable and stable laboratory resistance identification method on grapevine powdery mildew was established. The method is as follows： collect the 2-4 young leaves of the vine from top to bottom， make leaf discs using a borer with 15 mm diameter， place the leaf discs on a 1.5% water agar plate for moisturizing purpose， prepare the spore suspension directly with the conidia on the diseased leaves collected from the field， inoculate at the concentration of 2×105 conidia/mL， select resistant and susceptible grape varieties as the control， and resistance identification could be completed within 14 days. Resistance evaluation of 11 grape varieties （lines） to grapevine powdery mildew by this method showed that the resistance of the tested 11 varieties （lines） was significantly different. The highly susceptible varieties were ‘Kyoho ‘Summer Black ‘Shine Muscat etc.， the susceptible varieties were ‘Muscat and ‘Marselan， the resistant varieties were ‘Ruidu Kemei and ‘Nuclear Cuibao， the highly resistant variety was ‘Arctic Red. The resistant evaluation results provide method and basic reference data for screening and utilization of grapevine powdery resistant varieties.

Key words ：grapevine powdery mildew; variety; resistance identification

葡萄是世界上種植最廣泛的水果作物之一[1]。國際葡萄與葡萄酒組織OIV（Organisation Internationale de la Vigne et du Vin）發布的《2017年全球葡萄種植面積分析及預測》顯示，截至2017年，世界葡萄種植面積約為760萬hm2，我國葡萄種植面積約為87萬hm2。而我國主要的栽培品種一般對真菌病害的抗性表現不佳[2]。葡萄白粉病（grapevine powdery mildew）是葡萄栽培中最重要的真菌病害之一，在歐洲葡萄種植歷史上與葡萄霜霉病（grapevine downy mildew）和葡萄根瘤蚜Daktulosphaira vitifoliae Fitch并為三大病蟲害，曾導致法國的葡萄酒生產減產80%[3]。葡萄白粉病由白粉菌Erysiphe necator引起，可危害葡萄葉片、莖、果實等，除導致大幅減產外，還會影響果實及葡萄酒的品質[46]。目前化學防治仍是國內葡萄真菌病害防治的主要措施，其缺點為病原菌易產生抗藥性，并且產生農藥殘留和污染環境。選育抗病品種等無污染防治措施是現今研究的重點課題，因其便捷、經濟、有效的特點成為控制葡萄白粉病大面積暴發的有效途徑[78]。盡管我國主栽葡萄品種對白粉病的抗性較差，但是不同品種間存在抗、感差異，探究可靠的葡萄白粉病抗性鑒定方法可在一定程度上對抗病品種的快速選育起到重要作用[9]。目前國內已有的抗性鑒定方法有田間自然發病鑒定、田間人工接種鑒定和室內離體葉圓片（葉盤）接種鑒定。不同鑒定方法獲得的抗性結果存在顯著的一致性[911]。但是田間接種鑒定所需發病時間都較長，對大量葡萄品種進行快速抗病性鑒定耗時、耗力，而室內離體葉圓片接種鑒定方法穩定性較差[12]。本試驗在已有鑒定方法的基礎上，對接種不同菌源后發病情況進行比較，并對試驗方法的可行性及穩定性進行驗證，旨在為葡萄白粉病抗性品種的評價提供一種快速和可靠的鑒定方法，從而提高抗病品種的評價和選育效率。本試驗還用此方法對生產上的主栽葡萄品種和新培育品種（品系）進行了抗病性鑒定，為抗病品種的選育及利用提供了基礎參考數據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌源

在北京市林業果樹科學研究院葡萄資源圃采集感染白粉病菌的新鮮病葉帶回實驗室，作為接種體備用。

1.1.2 供試葡萄品種

抗、感對照篩選品種：歐亞種‘里扎馬特和‘京秀為生產中較感病品種;歐亞種和圓葉葡萄雜交后代‘R23‘Ms2731由北京市林業果樹科學研究院初步確定為抗病品種。供試接種葉片采自北京市林業果樹科學研究院葡萄資源圃健康植株。

抗病性鑒定品種：歐亞種有‘瑞都紅玉‘瑞都紅玫‘無核翠寶‘早黑寶‘玫瑰香‘馬瑟蘭‘瑞都科美;歐美雜種有‘陽光玫瑰‘夏黑‘巨峰;山歐雜種有‘北冰紅。供試接種葉片采自北京市海淀區、昌平區、延慶區、順義區的葡萄采摘園及葡萄資源圃健康植株。

1.1.3 培養基

1.5%水瓊脂培養基（WA）：瓊脂粉15 g，蒸餾水定容至1 000 mL。

1.2 試驗方法

1.2.1 接種體培養方法

1.2.1.1 田間采集

田間采集葡萄白粉病新鮮病葉，在體視顯微鏡下觀察菌斑，挑選分生孢子梗較直立、透明，分生孢子串生的病葉。用無菌水潤濕的脫脂棉包裹葉柄基部，置于密封袋中室溫保濕備用。待準備好葉盤后于采集當天完成接種。

1.2.1.2 離體葉片培養

從田間采集葡萄白粉病新鮮病葉，在體視顯微鏡下挑選出分生孢子梗較直立、透明，僅有1～2個分生孢子的白粉菌菌斑病葉放在長方形保鮮盒中保濕培養。培養前用75%乙醇消毒的尼龍畫筆（筆毛寬2.5 mm）輕輕刷掉菌斑上的老熟分生孢子。在長方形保鮮盒底部鋪放兩層濾紙和一層衛生紙加適量無菌水潤濕，將傾斜剪去葉柄基部的病葉插入潤濕的衛生紙。再用噴壺向葉片上方噴霧（勿直接對準葉片噴霧），使葉片表面均勻覆蓋細小霧滴，而無明顯水滴。最后用保鮮膜密封，放置（25±1）℃、相對濕度（60±10）%培養箱中培養5～7 d，葉面長出分生孢子備用。

1.2.2 接種體（孢子懸浮液）的制備

將田間采集的菌源或離體葉片培養的菌源在體視顯微鏡下鏡檢，觀察分生孢子生長情況。用尼龍畫筆將菌斑上的分生孢子刷至裝有無菌水的1.5 mL離心管，混勻，用血球計數板計數，將孢子濃度調至2×105個/mL備用。

1.2.3 接種葉盤的制備

選取葡萄藤自上而下第2～4片幼嫩葉片用于白粉病菌的接種。待接種葉片首先在體視顯微鏡下鏡檢，確保葉面無白粉菌菌落或菌絲后，用75%乙醇處理30 s，無菌水清洗3遍，然后用滅菌的濾紙吸干葉片表面的水分，用打孔器打取直徑15 mm的葉盤，均勻擺放在直徑9 cm玻璃培養皿內的水瓊脂培養基上。每皿擺放10個葉盤，葉正面朝上。

1.2.4 接種及培養

采用滴接法接種，用移液槍在每個葉盤中央接種20 μL孢子懸浮液，無菌水做空白對照。接種后2～3 min用無菌濾紙吸去葉盤表面的懸浮液，用封口膜封住培養皿，置于光照培養箱中25℃，L∥D=12 h∥12 h下培養14 d，每個處理3次重復，每個重復10個葉盤，接種后每天觀察發病情況。試驗重復2次。

1.2.5 發病情況調查及統計

葉盤接種后14 d，用體視顯微鏡觀察所有接種葉盤的發病情況。按葉盤病斑面積的百分比進行病害分級[13]，0級：無病斑;1級：病斑面積占葉盤面積的5%及以下;3級：病斑面積占葉盤面積的6%～25%;5級：病斑面積占葉盤面積的26%～50%;7級：病斑面積占葉盤面積的51%～75%;9級：病斑面積占葉盤面積的75%以上。按以下公式計算病情指數：

病情指數=∑（各級葉盤數×相應級數的代表值）/（總葉盤數×最高級數的代表值）×100。

1.2.6 抗病性鑒定指標

抗病性分級標準參照劉會寧等[12]的方法，分為5級，即免疫：病情指數0.00;高抗：病情指數0.10～5.00;抗病：病情指數5.01～25.00;感病：病情指數25.01～50.00;高感：病情指數50.00以上。

1.3 數據統計分析

試驗結果采用SPSS 21.0進行差異顯著性分析，Excel 2016進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 對照品種的確定

以田間采集菌源作為接種體，采用葉盤法對‘里扎馬特‘京秀‘R23和‘Ms2731進行抗、感對照品種的篩選。結果表明‘里扎馬特和‘京秀病情指數分別為75.56和86.67，為高感品種;‘R23和‘Ms2731病情指數均為0.00，為免疫品種，并且4個品種的重復性都較好。高感品種和免疫品種的發病情況有明顯差異，高感品種的葉盤上可產生較大面積，明顯的菌落，而免疫品種無菌落和孢子產生（圖1）。因此‘里扎馬特和‘京秀可作為抗病性鑒定中感病對照品種，‘R23和‘Ms2731為抗病對照品種。

2.2 接種體的確定

以田間采集菌源和離體培養菌源作為接種體，分別接種感病對照品種‘里扎馬特，進行抗病性測定試驗，比較接種體來源對抗性測定的影響。用田間采集菌源接種后病情指數為74.07±1.29，發病率為（100±0.00）%;離體培養菌源接種后病情指數為31.13±4.53，發病率為（87.83±5.27）%。結果表明離體培養菌源相較于田間采集菌源其病情指數及發病率均較低，且重復性差（圖2）。作為感病對照品種的‘里扎馬特葉盤，用離體培養菌源接種后的病情指數未能達到抗病性鑒定指標的最高分級（高感），故后續不同葡萄品種對白粉病的抗性鑒定試驗中使用田間采集菌源。

2.3 不同葡萄品種對白粉病的抗性鑒定

以田間采集菌源作為接種體，選取‘里扎馬特和‘R23分別作感病和抗病對照品種，采用離體葉盤法對11個葡萄品種（品系）進行葡萄白粉病抗性鑒定。肉眼觀察結合體視顯微鏡的觀察結果表明：不同品種（品系）接種白粉病菌后葉盤發病面積存在較大差異（圖3）。在體視顯微鏡下可以清晰觀察到發病部位菌落的形態，以及病斑面積統計時肉眼難以觀察到的病斑菌落邊緣（圖4）。統計結果顯示：病情指數區間為0.00～82.10，發病率區間為0.00%～100.00%。抗病性鑒定指標分級顯示高感品種為‘巨峰‘夏黑‘陽光玫瑰‘瑞都紅玉‘早黑寶和‘瑞都紅玫，占供試品種的54.54%;感病品種為‘玫瑰香和‘馬瑟蘭，占供試品種的18.18%;抗病品種為‘瑞都科美和‘無核翠寶，占供試品種的18.18%;高抗品種為‘北冰紅，占供試品種的9.09%（表1）。

3 結論與討論

李華等[9]曾報道可采用離體葉盤接種方法進行葡萄白粉病品種抗性的室內鑒定，但其接種發病時間較長，培養25 d后才進行嚴重度觀察。劉會寧等[12]參照此方法進行試驗，兩周后出現葉盤干枯現象導致室內試驗無果。本研究對葡萄白粉病抗性鑒定方法進行了優化，接種后沒有選取常規的濾紙保濕方法，而是用水瓊脂平板對葉盤進行保濕。經對兩種方法比較后發現，葉盤在水瓊脂平板上連續放置兩周依舊保持新鮮。本試驗用肉眼觀察結合體視顯微鏡鏡檢對葉盤發病等級進行調查統計。直接用肉眼觀察葡萄白粉病在葉盤上的菌落較為模糊，而在體視顯微鏡下能清晰看到菌落的分生孢子梗及串生的分生孢子（圖4a），也能清楚觀察到病斑擴展區的部分稀疏菌落（圖4b），使得調查統計結果更為準確可靠。有報道表明，葡萄霜霉病菌不同代數的菌源存在致病性差異[1314]。但筆者通過文獻查閱并未發現有關葡萄白粉病菌的相關報道。本研究比較了田間采集菌源以及離體培養菌源的接種效果，發現用田間采集菌源直接接種后，在相同時間內發病嚴重度高于離體培養菌源，能較快地進行抗性測定，但并未進行更多不同培養代數間的差異研究。并且本研究在進行品種抗病性鑒定前，預先通過接種試驗確定抗感病的對照品種，在對鑒定方法進行驗證的同時，也能對大量品種抗病性鑒定提供更加快速、可靠的發病嚴重度參照標準。

本研究通過葡萄白粉病抗病性鑒定方法的優化，對11個生產上主栽葡萄品種和新培育品種（品系）進行了白粉病抗性鑒定。其中‘巨峰‘瑞都紅玉‘早黑寶‘馬瑟蘭等為抗性較差品種，‘北冰紅為高抗品種，均與前人研究結果一致[1519]。本試驗中歐美雜種‘陽光玫瑰和‘夏黑鑒定為高感品種，病情指數分別高達79.63和81.48，田間觀察也發現‘陽光玫瑰和‘夏黑白粉病發病嚴重，與室內測定結果一致。但有研究表明這兩個品種為抗病品種[1921]，分析這可能與抗性鑒定方法不同等因素有關，有待進一步研究。與此同時，在‘陽光玫瑰‘夏黑等白粉病高感品種的種植過程中，對白粉病的發生情況應該予以關注。

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（責任編輯：楊明麗）