不同真菌和植物種類對苜蓿滑刃線蟲繁殖的影響

王珍 李冉 李紅梅 范鈞星 王暄

摘要 ：為探究美國進境苜蓿滑刃線蟲對真菌的取食特性以及對植物的寄生性，通過接種試驗觀察該線蟲在鏈格孢、灰葡萄孢、禾谷鐮刀菌、擬盤多毛孢和核盤菌等5種真菌，以及在菊花、大豆、苜蓿和三葉草等4種植物8個品種上的繁殖情況。結果表明，苜蓿滑刃線蟲能取食5種真菌的菌絲體，但是在各真菌上的繁殖系數（Rf）有明顯差異，在鏈格孢和擬盤多毛孢上能快速繁殖且數量很高，在灰葡萄孢上繁殖速度稍慢，但存活時間較長。接種苜蓿滑刃線蟲后，大豆品種新葉出現輕微畸形或褐色病斑，苜蓿品種新葉出現畸形萎縮，而菊花和三葉草葉片沒有癥狀;該線蟲在各植物上的Rf值均低于1，表明這些植物不是合適的寄主。研究結果可為我國口岸實施外來植物線蟲的檢疫措施提供參考。

關鍵詞 ：苜蓿滑刃線蟲; 真菌; 植物; 繁殖系數; 寄生性

中圖分類號：

S 432.45文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2019546

Effects of different fungi and plant species on reproduction of Aphelenchoides medicagus

WANG Zhen1， LI Ran1， LI Hongmei1*， FAN Junxing1，2， WANG Xuan1

（1. College of Plant Protection， Key Laboratory of Integrated Management of Crop Diseases and Pests， Ministry of

Education， Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095， China; 2. College of Agronomy， Xinjiang Agricultural

University， Key Laboratory of Pest Monitoring and Safety Control on Crop and Forest， Urumqi 830052， China）

Abstract ：In order to explore the characteristics of Aphelenchoides medicagus intercepted from the USA in terms of fungal feeding and plant parasitism， the inoculation tests were carried out to evaluate the reproduction of nematodes on five fungal species， including Alternaria sp.， Botrytis cinerea， Fusarium graminearum， Pestalotiopsis sp. and Sclerotinia sclerotiorum， and on eight varieties of four plant species， including Chrysanthemum×morifolium， Glycine max， Medicago sativa and Trifolium repens. The results showed that A.medicagus could feed on the mycelia of five fungi， but the reproduction rates （Rf） of the nematodes on different fungi were significantly different. The nematodes could reproduce rapidly on the mycelia of Alternaria sp. and Pestalotiopsis sp. with high numbers， and relatively slower on the mycelia of Botrytis cinerea with high longevity. After inoculation with A.medicagus， the young leaves of soybean varieties exhibited slightly deformity or brown lesion spot， and the young leaves of alfalfa varieties showed malformation and shrink， while no symptoms were observed on the leaves of chrysanthemum and clover. The Rf values of nematodes on inoculated plant species and varieties were less than 1， which indicated that these plants were not suitable hosts. The results provided the useful information for Chinese ports to implement the quarantine measures for the exotic plant nematodes.

Key words ：Aphelenchoides medicagus; fungi; plants; reproduction rate; parasitism

滑刃線蟲屬Aphelenchoides Fisher種類眾多，迄今該屬的有效種約有180個[1]。該屬大多數種為食真菌線蟲，已報道寄生植物的種有13個[2]，其中，能夠引起植物嚴重病害的種有貝西滑刃線蟲A.besseyi Christie，1942、草莓滑刃線蟲A.fragariae Ritzema（Bos，1890）Christie，1932和菊花滑刃線蟲A.ritzemabosi（Schwartz，1911）Steiner & Buhrer，1932這3個種，典型寄主分別為水稻、草莓和菊花等[3]。這3個種為植物遷移性內寄生或外寄生線蟲，寄主范圍廣泛，涉及種子植物門的98個科和蕨類植物門的25個科[2]，常為害植物的葉片、幼芽和莖稈，有時還可為害球莖、假根等，造成植物葉片皺縮、產生病斑和萎縮[3]，對多種觀賞植物或農作物的產量和品質造成嚴重影響，被聯合國農業和糧食組織（Food and Agriculture Organization of the United Nations，FAO）和國際植物保護公約（International Plant Protection Convention，IPPC）列為檢疫性有害生物[4]。世界各國都對檢疫性有害生物高度重視，我國政府也制定了嚴格的檢疫規程防止檢疫性線蟲在國際貿易中隨植物材料傳入。寧波海關在2017年1月對美國進境干苜蓿草Medicago sativa進行植物檢疫常規檢測時，從中截獲一未知滑刃線蟲屬群體，我們通過形態學和分子生物學鑒定將其描述為苜蓿滑刃線蟲A.medicagus Wang，Bert，Gu，Couvreur & Li，2019[5]。

為探究截獲的美國苜蓿滑刃線蟲取食真菌的特性以及是否具有植物寄生性，本文以5種真菌和4種植物8個品種為研究材料，通過接種試驗觀察苜蓿滑刃線蟲在不同真菌和植物上的繁殖情況，以及在植物上產生的癥狀等，以期揭示苜蓿滑刃線蟲的生物學特性，為我國口岸進境有害生物的植物檢疫提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 線蟲的繁殖和接種懸浮液制備

供試的苜蓿滑刃線蟲群體用改良貝曼漏斗法[6]分離自美國進境苜蓿草，貝西滑刃線蟲A.besseyi群體分離自安徽廬江水稻病粒。分別挑取各群體的單條雌蟲至長滿灰葡萄孢Botrytis cinerea不產孢突變菌株菌絲的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）平板（直徑3.5 cm）上，置于25℃恒溫箱中黑暗培養，待線蟲長滿平板后，獲得兩種線蟲的純化群體[7]。

將各純化群體進一步接種在長滿灰葡萄孢的PDA平板（直徑9 cm）上進行擴繁[7]，待線蟲長滿平板后，用貝曼漏斗法分離PDA平板上的線蟲并收集至10 mL離心管中，待線蟲沉淀后，移去大部分上清液，加入等體積的4 000 μg/mL硫酸鏈霉素溶液進行線蟲的表面消毒，充分混勻后靜置4～8 h，移除上清液后，用無菌水清洗3～4次。將表面消毒后的線蟲液定容至10 mL，搖勻后取200 μL均勻滴加多個小點于載玻片上，在體視顯微鏡下統計線蟲的數量，重復5次取平均值，根據定容體積計算出線蟲懸浮液的濃度，用于接種試驗。

1.2 測定5種真菌對苜蓿滑刃線蟲繁殖的影響

供試的5種真菌菌株分別是：鏈格孢菌一未知種Alternaria sp.（代碼Asp），分離自與苜蓿滑刃線蟲的來源相同批次的美國干苜蓿草樣品;灰葡萄孢不產孢突變菌株（Bc）由南京農業大學植物線蟲實驗室保存;禾谷鐮刀菌Fusarium graminearum（Fg）和核盤菌Sclerotinia sclerotiorum（Ss）由南京農業大學殺菌劑實驗室饋贈;擬盤多毛孢菌一未知種Pestalotiopsis sp.（Psp）由寧波海關技術中心饋贈;參考方中達[8]的方法進行真菌的繁殖和接種，在無菌條件下，分別挑取各菌株的菌絲接種至直徑9 cm的PDA平板上，將平板置于25℃恒溫箱中黑暗培養7～10 d。待各真菌菌絲長滿平板后，接種100 μL表面消毒的線蟲懸浮液（濃度1 000 條/mL）至各平板中央，即接種量為100條/皿。每種真菌設27個平板重復，線蟲接種第6天開始，每3 d取3個平板，觀察線蟲在真菌菌落上的繁殖情況并進行線蟲的分離和計數，至接種后第30天為止。線蟲分離和計數的方法同上。

1.3 測定4種植物對苜蓿滑刃線蟲繁殖的影響

供試的4種植物8個品種分別為：菊花Chrysanthemum×morifolium，品種‘紅太陽（代碼CmSun）和‘如煙（CmSmog）幼苗，由南京農業大學園藝學院菊花研究團隊饋贈;苜蓿Medicago sativa，品種加拿大‘3010（MsCAN）、法國‘三得利（MsFR）和中國‘甘農5號（MsCNG5）種子，由新疆農業大學農學院李克梅老師饋贈;大豆Glycine max，品種‘黑豆（GmB）和‘黃豆（GmY）以及三葉草Trifolium repens（Tr）種子購自市場。測定苜蓿滑刃線蟲在這些植物上的繁殖情況，以貝西滑刃線蟲接種作為陽性對照，以蒸餾水接種為陰性對照。各接種處理設4個重復。試驗獨立重復2次。

用于種植的塑料杯規格為直徑7 cm×高10 cm，盛有滅菌土（沙壤比1∶3）。菊花幼苗在塑料杯中定植2周后，參考徐建華等[9]的方法接種線蟲于植株新芽部位，接種量為3 000 條/株。‘黑豆和‘黃豆種子經25℃催芽2 d后，播種于塑料杯中，待幼苗長至4葉期，參考Meyer等[10]的方法接種線蟲于植株新芽部位，接種量為400 條/株。苜蓿和三葉草種子播種于塑料缽中，待苗長至4葉期進行間苗，選取長勢一致的健壯苗，參考Wang等[11]的方法接種線蟲于苗的生長點，接種量為400 條/株。

接種線蟲后，用保鮮袋包裹住有脫脂棉的植株接種部位，保濕48 h后去除保鮮袋和脫脂棉，將植株置于25℃溫室中培養，定期澆營養液。每隔3～5 d觀察各處理植株的生長情況以及葉、莖部位的癥狀表現等。30 d后，將各植株地上部的莖和葉組織分別剪成長約5 mm的碎塊，分別裝入10 mL離心管中，加入蒸餾水浸泡24 h后，用蒸餾水沖洗組織碎塊1～2次，收集液體至計數皿，隨機挑取數條線蟲制成臨時玻片，在光學顯微鏡下檢查確認線蟲種類后，在體視顯微鏡下對皿中線蟲進行計數。

1.4 數據分析

根據不同真菌菌株處理以及不同植物處理所分離到的線蟲總數，計算繁殖系數（reproduction rate，Rf），即分離所得線蟲總量與初始接種線蟲量的比值。用Microsoft Excel 2016計算繁殖系數的平均值和標準誤（SE），用軟件DPS進行數據分析，利用Duncan氏新復極差法在P=0.05水平上進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 苜蓿滑刃線蟲對5種真菌菌絲體的取食特性

將苜蓿滑刃線蟲接種5種真菌菌落平板后，觀察線蟲取食菌絲體的情況，接種后第9天鏈格孢（Asp）、灰葡萄孢（Bc）、擬盤多毛孢（Psp）和核盤菌（Ss）菌落中央均呈現明顯的線蟲取食圈，菌落中央凹陷（圖1），第12～15天，線蟲取食圈持續擴大，15 d時平板上的氣生菌絲完全消失，而禾谷鐮刀菌（Fg）菌落在第12天才出現明顯的線蟲取食圈，30 d 時平板上菌落邊緣仍然可見氣生菌絲。

從圖1中可以看出，鏈格孢的灰白色菌落被線蟲取食殆盡后，平板呈灰黑色;灰葡萄孢突變菌株只產白色氣生菌絲，菌絲被線蟲取食完后平板呈淺灰色;禾谷鐮刀菌的淡粉色氣生菌絲被線蟲取食后，平板呈粉紅色;擬盤多毛孢白色氣生菌絲被線蟲取食殆盡后，平板呈淺灰色并且有大量的子實體黑色小顆粒;核盤菌白色氣生菌絲被全部取食完后，平板呈淺灰色并且有大量的黑色菌核，表明苜蓿滑刃線蟲主要取食這些真菌的氣生菌絲和分生孢子，不取食它們產生的子實體和菌核等。

2.2 5種真菌菌落上苜蓿滑刃線蟲的繁殖量比較

在5種真菌菌株平板上接種苜蓿滑刃線蟲后，統計線蟲的繁殖系數（Rf），從繁殖系數動態可以看出（表1），接種第15天時，線蟲在鏈格孢（Asp）和擬盤多毛孢（Psp）上的繁殖數量達到最高峰，Rf值均超過1 000，與灰葡萄孢菌（Bc）、禾谷鐮刀菌（Fg）和核盤菌（Ss） 3個處理的Rf值有顯著差異（P<0.05）。灰葡萄孢處理的Rf值在接種第27天時達到最高，為929，與其他真菌處理有顯著差異（P<0.05）;核盤菌處理的Rf值在接種第24天時達到最高，為203，禾谷鐮刀菌處理的Rf值在接種第27天時達到最高，為92.7，這兩種真菌處理的Rf值均顯著低于其他3個真菌處理（P<0.05）。接種第30天時，灰葡萄孢和擬盤多毛孢處理的Rf值均顯著高于其他3個真菌處理，表明苜蓿滑刃線蟲在這2種真菌平板上不僅能大量繁殖，且能夠以高群體密度存活較長時間。

2.3 不同植物上線蟲產生的癥狀觀察

將苜蓿滑刃線蟲和作為對照的貝西滑刃線蟲接種供試植物后，觀察30 d內線蟲產生的癥狀。貝西滑刃線蟲接種后第6天，

菊花品種‘紅太陽呈現心葉干枯褐色壞死，

菊花品種‘如煙的新葉呈現明顯皺縮、發育不良，隨后干枯壞死，

‘黑豆和‘黃豆的接種葉片葉脈上均出現黃色至褐色病斑，3個苜蓿品種‘三得利‘3010和‘甘農5號的新生葉片均出現明顯的皺縮和畸形癥狀，而三葉草在接種9 d后出現新生葉片發育不良、畸形和皺縮的癥狀。苜蓿滑刃線蟲接種后第6天，‘黑豆新葉末端邊緣產生輕微的畸形，沒有出現病斑，‘黃豆葉片出現細小的褐色病斑，但葉片沒有畸形;3個苜蓿品種的葉片畸形，不能正常展開，莖稈發育不良;而菊花品種‘紅太陽和‘如煙以及三葉草接種新葉均未出現明顯癥狀，與對照植株沒有差異。接種后第30天，所有供試植物的癥狀只局限在接種部位新葉上，其他部位沒有出現癥狀（圖2）。

2.4 不同植物上線蟲的繁殖量比較

在供試植物上接種苜蓿滑刃線蟲和貝西滑刃線蟲30 d后，分離植株地上部莖葉組織中的線蟲，鏡檢觀察發現線蟲主要分布在植株的接種部位附近組織，其他部位組織中沒有分離到線蟲。對分離的線蟲數量進行統計并計算繁殖系數（Rf），結果顯示（表2），接種苜蓿滑刃線蟲后，苜蓿品種‘3010處理的線蟲Rf值最高，為0.272，與其他植物處理的Rf值呈現顯著差異（P<0.05），但是苜蓿滑刃線蟲在所有供試植物上的Rf值均低于1，表明這些植物不適合苜蓿滑刃線蟲的正常繁殖。接種貝西滑刃線蟲后，苜蓿品種‘三得利處理的線蟲Rf值最高，為0.139，而菊花品種‘如煙處理的線蟲Rf值最低，這兩個處理的Rf值之間差異顯著（P<0.05）。

3 討論

滑刃屬線蟲可取食多種真菌，貝西滑刃線蟲Aphelenchoides besseyi[12]、蘑菇滑刃線蟲A.composticola[13]均可在鏈格孢Alternaria alternata上正常生長繁殖。本文將苜蓿滑刃線蟲接種至5種真菌上，發現線蟲可取食所有供試真菌的菌絲體，但是取食速度和繁殖數量不同，取食鏈格孢（Asp）和擬盤多毛孢（Psp）速度最快，且繁殖數量最多，培養15 d繁殖系數達1 000以上，推測苜蓿滑刃線蟲對這兩種真菌的偏好性較強。滑刃屬線蟲用口針刺穿真菌細胞壁后取食營養，不同種類的真菌其細胞壁化學組分和厚度存在差異，對線蟲的取食效率可能會產生影響，從而造成線蟲在不同真菌上的繁殖數量存在明顯差異[14]。滑刃屬線蟲可在鐮刀菌屬Fusarium多種真菌上繁殖生長，貝西滑刃線蟲在串珠鐮刀菌F.moniliforme、茄鐮刀菌F.solani和木賊鐮刀菌F.equiseti [12]上均可正常生長繁殖，蘑菇滑刃線蟲在尖孢鐮刀菌F.oxysporum[13]，以及雙尾滑刃線蟲A.bicaudatus在厚垣鐮刀菌F.chlamydosporum[14]上均可正常生長繁殖，但這些線蟲在不同種類真菌上的繁殖系數均存在顯著差異。此外，真菌產生的次生代謝產物也會影響線蟲的生理活動，阻礙線蟲活動或卵的孵化，嚴重時直接造成線蟲死亡，影響線蟲群體在真菌上的繁殖[15]。禾谷鐮刀菌F.graminearum可產生脫氧雪腐鐮孢菌烯醇（deoxynivalenol，DON）和玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）等真菌毒素，對真核生物有一定毒性，可引起人畜的急慢性中毒[16]，而本研究的苜蓿滑刃線蟲是真核生物，推測禾谷鐮刀菌產生的毒素對該線蟲的生長和繁殖有影響，從而導致在禾谷鐮刀菌上的繁殖數量顯著低于其他真菌。

柯赫氏法則（Kochs postulates）是大多數侵染性病害診斷的基本準則，對新病害病原物的確定更為重要。Meyer等[10]通過柯赫氏法則證實貝西滑刃線蟲A.besseyi是引起巴西大豆“Soja Louca II”病的病原物，發病植株呈現莖葉畸形和萎縮，花芽無法正常分化，豆莢發育受阻和產生棕色壞死斑等癥狀。本文中，分離自水稻的貝西滑刃線蟲接種后在兩個大豆品種‘黑豆和‘黃豆植株葉片的葉脈部位產生了輕微的黃色至褐色病斑，線蟲的繁殖系數均低于1，表明與引起巴西大豆“Soja Louca II”病的貝西滑刃線蟲相比有明顯的致病力差異。Oliveria等[17]將分離自草莓的貝西滑刃線蟲群體接種草莓、非洲菊、大豆和苜蓿后，在草莓和非洲菊植株葉片上產生明顯的皺縮或畸形等癥狀，但在大豆和苜蓿上無明顯癥狀出現;接種60 d后，在草莓上的繁殖蟲量低于初始接種量，而在非洲菊上的繁殖蟲量高于初始接種量，推測非洲菊是貝西滑刃線蟲的又一新寄主，而兩種植物葉片的結構差異可能是造成線蟲數量分布不同的原因。苜蓿滑刃線蟲分離自美國進境干苜蓿草，接種苜蓿3個品種后，接種部位均呈現葉片畸形萎縮和莖稈發育不良，但是線蟲的繁殖系數均小于1，表明這3個苜蓿品種不是苜蓿滑刃線蟲的合適寄主。然而，線蟲群體的繁殖能力常因寄主不同或地理區域不同而存在差異[1820]，苜蓿滑刃線蟲在加拿大品種的繁殖率顯著高于法國和中國品種，推測來自北美的苜蓿品種可能更適于該線蟲的繁殖。此外，苜蓿滑刃線蟲接種兩個大豆品種后，只在接種部位葉片上產生畸形或褐色病斑癥狀，且繁殖系數均低于1，推斷大豆不是苜蓿滑刃線蟲的合適寄主。苜蓿滑刃線蟲是否具有植物寄生特性，還需要進一步對更多的植物種類進行接種測定。

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（責任編輯：田 喆）