固沖湯對IgA腎病模型大鼠腎組織TGF-β1含量及病理形態的影響

唐 峰，余舒文，方 靖，余楊樺

0 引言

IgA腎病是全球最常見的原發性腎小球疾病，占原發性腎小球疾病的25%～50%[1]，病理表現為腎小球系膜細胞增生及基質增多，以IgA為主的免疫復合物沉積，臨床以血尿和蛋白尿為主要表現。IgA腎病中醫常從“尿血”“水腫”“腎風”等論治，究其病因病機常責之為腎虛。從中醫角度來看，IgA腎病患者常素體虧虛，加之風濕之邪內擾于腎，腎虛不固，封藏失司，精微之物由小便流失，而固沖湯補腎固沖止血的作用恰好與之相應。目前有研究發現，TGF-β受體的激活在腎組織纖維化中起著重要作用[2-3]。TGF-β1通過誘導腎小球系膜細胞及足細胞凋亡，加速細胞外基質的生成及沉積，加重腎小管間質病變，刺激腎小球硬化，進而使疾病惡化[4-5]。本研究基于上述理論基礎及臨床研究，觀察固沖湯對IgA腎病模型大鼠腎組織病理變化的影響，并通過觀察腎組織TGF-β1含量的變化，探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 SD大鼠40只，雌性，體重(140±10) g，12周齡，由浙江中醫藥大學實驗動物中心提供，并由浙江中醫藥大學實驗動物中心飼養及管理，飼養于清潔級大鼠實驗室中。實驗動物生產許可證號：SCXK(滬)2017-0005，實驗動物使用許可證號：SYXK(浙)2018-0012。經普通飼料適應性喂養1周后，采用隨機數字表法，將動物分為正常組、模型組、固沖湯組、福辛普利對照組，每組10只。

1.2 主要試劑藥物及儀器 福辛普利(蒙諾)購自余杭區第一人民醫院；固沖湯水煎濃縮液(山萸肉、煅龍骨、煅牡蠣、炒白術、生黃芪、炒白芍、棕櫚炭、五倍子、海螵蛸、茜草)，藥材購自浙江省中醫院；牛血清白蛋白(BSA)購自深圳晶美生物有限公司；葡萄球菌腸毒素B(SEB)購自中國軍事醫學科學院微生物流行病研究所；兔抗大鼠IgA抗體購自上海信然生物技術有限公司；TGF-β1檢測試劑盒購自美國Promega公司。自動生化分析儀、高速離心機、光學顯微鏡、日本Olympus熒光顯微鏡，由余杭區第一人民醫院提供。

1.3 造模 參照文獻[6-8]的造模方法，正常組隔日予生理鹽水4 ml/kg灌胃，模型組、固沖湯組、福辛普利組自實驗的第1天起隔日0.1%BSA酸液400 mg/kg灌胃，第6周尾靜脈注射1%BSA緩沖液20 mg/kg，1次/d，連續3次，第8周尾靜脈注射葡萄球菌腸毒素(SEB) 0.8 mg/kg，每周1次，連續3周，同時腹腔注射弗氏佐劑。

1.4 干預方法 造模第8周開始給予相應的藥物灌胃，連續5周，每次給藥劑量按照“由成人量(mg/kg)換算成動物劑量的倍數簡表”計算，即固沖湯組灌服固沖湯水煎濃縮液，福辛普利組(蒙諾)灌服福辛普利水溶液(藥品，藥物溶于生理鹽水)，正常組及模型組予等量的生理鹽水灌胃。

1.5 觀察指標及檢測方法 第12周實驗結束，頸椎脫臼法處死大鼠，無菌摘取大鼠右側腎臟，腎組織常規固定、脫水、石蠟包埋、切片，進行HE、PAS、Masson、免疫熒光顯色，顯微鏡下觀察并拍照。①HE染色法觀察腎組織病理形態學變化及IgA沉積：腎組織經10%中性緩沖福爾馬林固定，梯度酒精脫水，二甲苯透明、浸蠟、包埋、切片后，行常規HE染色顯微鏡下觀察。②Masson染色：腎組織經10%中性緩沖福爾馬林固定，梯度酒精脫水，二甲苯透明、浸蠟、包埋、切片后，行常規Masson染色顯微鏡下觀察。③PAS染色：腎組織經10%中性緩沖福爾馬林固定，梯度酒精脫水，二甲苯透明、浸蠟、包埋、切片后，行常規PAS染色顯微鏡下觀察。④免疫熒光法檢測腎組織：直接法染色，取新鮮腎臟組織進行冰凍切片(4 μm)，干燥、冷丙酮固定10 min，PBS液洗后滴加FITC標記的兔抗大鼠IgA抗體，溫度37 ℃烘箱中孵育40 min，PBS液洗后用緩沖液甘油封片，熒光顯微鏡下觀察。⑤ELISA法檢測腎組織TGF-β1含量：制備腎組織勻漿，按照Promega公司提供的TGF-β1雙抗體夾心方法檢測。

2 結果

2.1 各組大鼠腎臟病理染色結果比較 HE染色實驗顯示，福辛普利組和固沖湯組大鼠腎小球有部分炎癥反應，部分系膜增生，少量腎小球周圍管腔變窄，組織中有少量出血和空泡現象。模型組大鼠腎小球炎癥反應增多，系膜增生，基質增厚，腎小球周圍管腔變窄，出血嚴重，腎小管上皮細胞腫脹嚴重，部分腎小管壁呈空泡樣。正常組腎小球周圍空隙較大，腎小球內致密區正常，近曲小管、遠曲小管的管腔清晰，上皮細胞正常，血管腔內清晰。Masson實驗顯示，福辛普利組和固沖湯組有少量腎小球系膜組織增生和少量的基膜增厚；模型組可見中重度系膜組織增生，系膜基質增厚，部分腎小管腫脹。PAS染色中，福辛普利組和固沖湯組腎小球中的糖原比正常組有少量增多。模型組可見腎小球中的糖原有明顯增多。見圖1～圖3。

圖1 各組大鼠腎臟HE染色結果比較(HE，200×)

圖2 各組大鼠腎臟Masson染色結果比較(200×)

圖3 各組大鼠腎臟PAS染色結果比較(200×)

2.2 大鼠腎臟IgA沉積情況 組織免疫熒光檢測可見，IgA蛋白主要在血管上皮上表達，在腎小球上有少量表達。見圖4。

圖4 各組大鼠IgA沉積情況(200×)

2.3 各組大鼠腎組織TGF-β1含量比較 通過雙抗體夾心檢測方法檢測各組大鼠腎組織TGF-β1含量。與正常組比較，福辛普利組、固沖湯組大鼠腎組織TGF-β1表達明顯增強(P<0.05)；與模型組比較，正常組TGF-β1表達較弱(P<0.05)；與模型組比較，固沖湯組大鼠腎組織TGF-β1表達明顯減弱(P<0.05)。見圖5。

圖5 各組大鼠腎組織TGF-β1含量比較

3 討論

傳統醫學并無IgA腎病的診斷，根據其水腫、泡沫尿、血尿以及終末期的少尿、無尿，大多以“水腫”、“關格”、“尿濁”等論治。其主要病因責之先天不足，或因飲食、內傷、情志、勞倦導致正氣不足，復感外邪而發，其病機為本虛標實、虛實夾雜，多兼有濕、熱、虛、瘀。病位在腎，與肝、脾、肺等臟腑密切相關。固沖湯源于張錫純的《醫學衷中參西錄·治婦科方》，具有固沖攝血、補脾益腎的功效。張錫純認為，腎虛不固是崩漏發生的關鍵原因，即固沖湯的主治證，臨床可見猝然血崩或月經過多，或漏下不止，兼見頭暈，腰膝酸軟，神疲乏力，初起舌色如常，隨出血量增多，氣隨血脫，可見氣短肢冷，舌淡等脾腎二虛證候，舌色如常，不紅、不淡、無瘀點瘀斑。正因為固沖湯具有的補腎固沖攝血、疏肝健脾的功效，故可用于治療慢性腎炎。

固沖湯由白術、生黃芪、龍骨、牡蠣、山萸肉、生白芍、海螵蛸、茜草、棕櫚炭、五倍子組成，具有固沖攝血、補脾益腎的功效。方中山萸肉味酸而溫，兼具收斂固澀、補益肝腎及通經絡的作用，為君藥。龍骨甘澀，牡蠣咸澀，煅用收澀之效更強，合用以助君藥固澀滑脫，為臣藥。張錫純常將此三藥共用，作為收斂止血或救元氣欲脫的常用配伍。白術益氣健脾固沖，黃芪補氣升提，合用使脾氣旺而統攝有權。在糖尿病腎病模型大鼠實驗中發現，黃芪能夠誘導腎臟成纖維細胞c-met表達增加，從而達到抑制TGF-β1的表達[9]。另有報道，黃芪有效成分黃芪多糖能夠抑制腎臟TGF-β1/Smads信號通路的活性，從而減少蛋白尿，降低血肌酐，保護腎功能[10]。生白芍有養血、斂陰、緩中之功，現代藥理證實，其有效成分白芍總苷具有免疫抑制作用，能夠抑制炎性因子，改善炎癥狀態，達到保護腎臟的作用[11]。棕櫚炭、五倍子收斂止血，海螵蛸、茜草固澀止血兼化瘀，止血卻不留瘀，均為佐藥。全方脾腎兼顧，固澀和補益相結合，固澀止血的同時，又止血不留瘀，固澀攝血和化瘀相結合，共奏固沖攝血，益氣健脾之功。

IgA腎病是以IgA為主的免疫復合物彌漫沉積在腎小球系膜區及血管袢的臨床綜合征，而腎臟病理檢查則是評估腎小球損害程度的重要手段。本研究中，正常組大鼠腎組織未見明顯異常，而模型組、固沖湯組、福辛普利組大鼠腎臟病理可見腎小球炎癥反應，系膜增生，腎小球周圍管腔變窄、出血，腎小管上皮細胞腫脹，部分腎小管壁呈空泡樣，腎小球糖原增多。但福辛普利組和固沖湯組大鼠腎小球損害程度明顯輕于模型組，可見固沖湯能夠使IgA腎病模型大鼠腎組織病理變化程度明顯減輕，起到保護腎臟的作用。

TGF-β1是由T細胞、脂多糖分泌的一種多功能細胞因子，可以與細胞表面的TGF-β1受體結合而激活其受體[2]。TGF-β1對間充質起源的細胞起刺激作用，而對上皮或神經外胚層來源的細胞起抑制作用[12]，其主要功能是抑制淋巴細胞的分化，促進成纖維細胞、成骨細胞和雪旺氏細胞的生長，抑制免疫活性細胞的增殖，促進細胞外基質(ECM)如膠原蛋白、纖黏連蛋白的表達和抑制ECM的降解，對細胞形態的增殖和分化過程起著重要作用[13-14]。TGF-β1對早期的組織損傷具有修復及再生的作用，但若過度表達可導致腎組織反復損傷。在腎臟，TGF-β1主要位于腎小球、腎小管、腎間質，TGF-β1對疾病進程的影響是通過誘導腎小球系膜細胞及足細胞凋亡來實現的[4]。另有研究發現，TGF-β1可加速細胞外基質的生成及沉積，加重腎小管間質病變，刺激腎小球硬化，進而使IgA腎病趨向惡化發展[5]。李海劍等[15]的臨床研究發現，IgA患者Haas分型、Katafuchi分級與腎組織中TGF-β1呈正相關，是病情惡化的重要因素之一。樊平等[16]關于老年IgA腎病患者的研究顯示，患者組織、血液及尿液中TGF-β1水平顯著升高，且與疾病嚴重程度呈正比。于建軍等[17]將100例IgA腎病患者根據Lee氏分級分為輕、中、重3組，分別檢測血液中TGF-β1水平，結果顯示，根據病情進展，TGF-β1水平進行性升高，也證明TGF-β1水平與IgA腎病嚴重程度呈正相關。而關于兒童IgA腎病的相關文獻亦報道，TGF-β1在兒童患者的尿液中表達較正常組明顯增加，且較血液檢測敏感[18]。以上研究均表明，TGF-β1不僅是腎小球損傷的標志，而且可以用于預測IgA腎病轉歸與預后。本研究顯示，IgA腎病模型大鼠腎組織TGF-β1含量明顯升高，而固沖湯可降低模型組大鼠腎組織TGF-β1含量。

綜上所述，固沖湯對腎臟的保護作用可能與抑制腎臟TGF-β1的表達，抑制細胞外基質的生成，減輕腎小管間質病變有關，從而達到緩解疾病進程的目的。結果表明，固沖湯對腎臟保護機制可能與抑制TGF-β1的表達，減少細胞外基質生成有關。