間充質干細胞凝膠對大鼠四期壓瘡創面愈合的作用及機制

王旌臻，胡芳 ，張杰，白曉溫

1天津醫科大學總醫院普外科，天津 300052；2天津醫科大學總醫院護理部，天津 300052

壓瘡（PU）是由于壓力和（或）摩擦力等其他外力長期作用下導致的皮膚局限性損傷。老年患者常因合并基礎病、組織修復能力弱等原因易形成難愈性瘡面，其中重度PU不僅為老年人身心帶來痛苦，更嚴重者可致全身感染，危及生命[1]。目前創面治療主要以濕性愈合理念為主，并通過手術、負壓吸引等方式促進修復[2]。近年來間充質干細胞（MSCs）為損傷治療提供了新方法，它具有多向分化潛能，可促進生長因子的釋放及血管化[3]。但人胎盤MSCs凝膠在不同愈合環境中的作用效果是否存在差異，有待進一步研究。2019年10月—2020年10月，本研究以缺血再灌注損傷制備大鼠四期PU模型，比較不同愈合環境下的創面愈合率，血清炎性因子水平，為MSCs凝膠在PU中的臨床應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 126只雄性清潔級SD大鼠（中國大興食品藥品檢定研究院）。根據文獻報道大鼠皮膚厚度在幼年及老年時期均較中年時期薄，幼年與老年大鼠皮膚厚度相近，且幼年大鼠更便于造模儀器的固定、有利于實驗模型的成功建立，故選擇鼠齡為4～6周。質量（170±5）g，許可證號 SCXK（京）2017-0005，實驗動物倫理批件號IRB2020-DW-06。大鼠造模前分籠適應性飼養1周，造模及治療期間不限制飲食，可自由活動，明暗周期12 h。

1.2 試劑 人胎盤MSCs凝膠（北京漢氏聯合生物技術股份有限公司）；水膠體敷料、清創膠（康樂保醫療有限公司）；大鼠IL-10 ELISA試劑盒（深圳達科為生物科技有限公司）；大鼠TNF-α和VEGF ELISA試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司）。

1.3 造模方法 大鼠編號后，按照隨機數字表法選取6只作為正常組。其余120只大鼠進行PU造模[4]：①10%水合氯醛（300 mg/kg）腹腔注射麻醉后，大鼠背部皮膚備皮4 cm×6 cm，按照標記序號依次以兩塊圓形磁鐵（直徑12 mm，厚度5 mm，磁通量4 000 G）將大鼠背部皮膚對稱夾起，皮膚被壓厚度（5±2）mm，中間空余折疊皮膚長度約1 cm。磁鐵壓迫3 h后，放松0.5 h，以此為一個循環，兩次循環后繼續壓迫過夜約16 h至次日晨。②次日晨磁鐵放松1 h后，其余造模方法同前日。③經兩日壓迫后，大鼠背部磁鐵再次放松1 h，以10%水合氯醛（300 mg/kg）腹腔麻醉，75%酒精消毒受壓背部皮膚，使用高溫滅菌后的皮膚打孔器做8 mm圓形創傷。PU成模標準[5]：全層皮膚和組織的缺失，創面伴有可見或可觸及的筋膜、肌肉、肌腱、軟骨或骨外露，傷口床可見腐肉和（或）焦痂及傷口炎性滲液或滲血。本造模方法簡單可行，造模過程中無大鼠死亡。

1.4 分組及干預方法 將120只PU模型大鼠隨機分為對照組、干性-臨床組（GL組）、濕性-臨床組（SL組）、干性-干細胞組（GG組）及濕性-干細胞組（SG組），每組24只。對照組無治療措施，自然愈合；GL組予以涂抹碘伏+紗布包扎；SL組予以涂抹清創膠+水膠體覆蓋；GG組予以涂抹MSCs凝膠+紗布包扎；SG組予以涂抹MSCs凝膠+水膠體覆蓋。治療15 d，治療期間每隔3天采用生理鹽水清創后，重新換藥包扎。

1.5 評價指標

1.5.1 創面愈合率 治療第3、6、9、15天時，各組隨機選取6只大鼠測量創面面積，以創面完全上皮化作為愈合判定標準，使用Image-pro Plus6.0圖像分析軟件進行計算，創面愈合率=（原始創面面積-未愈合創面面積）/原始創面面積×100%。

1.5.2 血清炎性因子TNF-α、IL-10及VEGF水平正常組大鼠麻醉后采集腹主動脈血5 mL，其余5組大鼠在治療第3、6、9、15天時，隨機選取6只采集腹主動脈血5 mL。轉速3 000 r/min離心15 min后取血清，采用ELISA法測定炎性因子TNF-α、IL-10及VEGF水平。

1.6 統計學方法 采用SPSS22.0統計軟件。符合正態分布的計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，多個均數間兩兩比較采用SNK-q檢驗。檢驗水準α=0.05，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠不同時點創面愈合率比較 治療3 d時，GG組、SG組創面愈合率均高于對照組，GG組創面愈合率高于SG組（P均＜0.05）。治療6 d時，SL組、GG組、SG組創面愈合率均高于對照組（P均＜0.05），GG組創面愈合率高于SG組（P均＜0.05）。治療15 d時，各治療組中GG組創面愈合率最高、GL組創面愈合率最低，且均高于對照組（P均＜0.05）。治療6 d、9 d、15 d時，SL組創面愈合率均高于GL組（P均＜0.05），GG組創面愈合率均高于SG組（P均＜0.01）。見表1。

表1 各組大鼠不同時點創面愈合率比較（%，±s）

表1 各組大鼠不同時點創面愈合率比較（%，±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與SL組比較，△P＜0.05；與GG組比較，#P＜0.01。

組別觀察時間n 6 6 6 6 6 3 d 9.14±1.24 10.37±0.88△7.74±0.93 18.82±1.20*△12.28±1.03*△#72.60＜0.01 15 d 78.43±3.62 84.13±1.48*△88.23±2.11*97.81±1.19*△92.43±3.14*△#44.80＜0.01對照組GL組SL組GG組SG組F值P值6 d 11.85±1.19 12.63±0.78△16.68±1.47*32.86±3.20*△21.65±2.55*△#88.41＜0.01 9 d 23.89±0.88 28.62±1.69*△35.47±3.19*62.68±4.27*△42.07±4.46*△#110.31＜0.01

2.2 各組血清TNF-α、IL-10及VEGF水平比較

2.2.1 血清TNF-α水平 治療3 d時，對照組血清TNF-α水平高于正常組（P＜0.01），各組均在3 d時達高峰。治療9 d、15 d時，SL組血清TNF-α水平均低于GL組，GG組血清TNF-α水平均低于SG組（P均＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠不同時點血清TNF-α、IL-10及VEGF水平比較（ng/mL，±s）

表2 各組大鼠不同時點血清TNF-α、IL-10及VEGF水平比較（ng/mL，±s）

注：與正常組比較，*P＜0.01；與SL組比較，△P＜0.05；與GG組比較，#P＜0.05；與對照組比較，aP＜0.05；與SG組比較，bP＜0.05。

TNF-α 327.34±28.71 IL-10 132.26±15.26組別正常組對照組3 d 6 d 9 d 15 d GL組3 d 6 d 9 d 15 d SL組3 d 6 d 9 d 15 d GG組3 d 6 d 9 d 15 d SG組3 d 6 d 9 d 15 d VEGF 11.34±0.76 728.79±39.79*665.05±48.15 568.94±38.85 512.25±32.61*198.15±20.37*#173.84±23.07#156.44±8.56#130.76±13.72#15.27±1.43*△17.89±1.39△16.29±1.10△12.09±1.06△681.05±34.95*636.47±41.84 530.26±36.48△462.14±36.78*△229.50±13.59*△#201.70±11.23△#177.36±8.26△#135.30±13.15#17.57±1.25*a 20.57±1.06a 19.15±0.80a 13.85±0.98*a 630.69±32.19*567.81±34.34 455.98±32.18 420.06±28.28*256.39±11.91*#228.14±17.35#197.74±12.19#139.74±12.02#22.00±0.46*b 23.03±0.66b 22.03±1.22b 15.39±0.71*b 580.06±42.39*a 529.95±35.58a 399.29±30.88a 363.12±28.71a 364.38±15.61*308.89±19.40 255.42±13.41 180.62±10.76*24.97±2.71*a 28.80±2.96a 32.60±2.75a 18.31±0.58*a 19.93±0.63*a#25.75±0.87a#26.80±1.45a#16.63±0.43*a#656.64±33.21*#a 587.50±30.17#a 460.72±29.32#a 395.22±33.76*#a 303.90±17.84*△#a 258.98±18.87△#a 230.50±24.48△#a 161.98±10.83*△#a

2.2.2 血清IL-10水平比較 治療3 d時，對照組血清IL-10水平高于正常組（P＜0.01）。各組均在3 d時達高峰。治療3 d、6 d、9 d、15 d時，GG組血清IL-10水平均高于其余各組，SG組血清IL-10水平均高于SL組（P均＜0.05）。治療3 d、6 d、9 d時，SL組血清IL-10水平均高于GL組（P均＜0.05）。治療15 d時，GG組與SG組血清IL-10水平均高于正常組（P均＜0.01）。見表2。

2.2.3 血清VEGF水平比較 治療3 d時對照組血清VEGF水平高于正常組（P均＜0.01）。各治療組各時點血清VEGF水平均高于對照組（P＜0.05）。治療3 d時，SL組血清VEGF水平高于SG組（P＜0.05）。治療3 d、6 d、9 d、15 d時，GG組血清VEGF水平均高于SG組（P均＜0.05）。GL組和SL組血清VEGF水平于6 d時達高峰，GG組和SG組血清VEGF水平于9 d時達高峰。見表2。

3 討論

3.1 炎性因子在損傷愈合中的變化趨勢 四期PU發生于全層皮膚，是伴有可見的筋膜、肌肉或骨外露的重度損傷[6]。創面的愈合常包含三個時期，即炎癥反應、肉芽組織形成和創面修復重建。各種細胞因子的調控在創面愈合中具有重要作用。適度的炎癥反應可清除壞死組織，維護組織的正常愈合，但在慢性創面中，炎性因子的過度釋放引發瀑布式級聯反應。

TNF-α是由巨噬細胞和T細胞產生的促炎性細胞因子[7]，可損傷血管內皮細胞，也可誘導IL-10表達。IL-10是抗炎性細胞因子，可促進巨噬細胞合成和釋放抗炎因子，同時也能抑制TNF-α受體表達。機體炎癥的反應程度在一定程度上可通過抗炎因子與促炎因子的相互作用體現。本研究發現，治療3 d時對照組血清TNF-α、IL-10水平均高于正常組，且各組均在3 d時達高峰，表明PU愈合初期炎癥反應最為明顯，巨噬細胞等免疫細胞參與炎癥反應，PU愈合后期主要表現為組織修復，故隨著各組創面逐漸愈合，炎癥反應逐漸減弱，炎性因子表達隨之降低。

VEGF可調控血管內皮細胞的增殖與遷移。缺血缺氧的創面刺激VEGF表達增多，促進血管內皮細胞增殖及微小血管的新生，滿足損傷的血液供應[8]。本研究發現，治療3 d時對照組血清VEGF水平高于正常組，且VEGF水平于6 d時達高峰，提示對照組血清VEGF水平較正常組表達呈應激性增多，之后下降，逐漸向正常皮膚組織表達水平回落。考慮隨著PU創面缺血缺氧狀態逐漸改善，大量成纖維細胞增殖，新生血管減少，繼而VEGF水平呈下降趨勢。

3.2 濕性密閉愈合環境有利于壓瘡創面愈合 PU難以愈合受多種原因影響，例如炎癥介質血供不足。以往PU的治療常采用紗布等干性敷料，干性環境易使傷口干燥，阻礙表皮細胞遷移。越來越多的研究表明，保持創面濕性愈合環境更有利于愈合[9-10]。密閉濕潤環境可預防外部細菌感染，保持多種酶和酶的活化因子的活性，促進纖維蛋白及壞死組織的溶解，加速細胞的增殖和分化。治療6 d、9 d、15 d時，SL組創面愈合率均高于GL組，表明濕性愈合環境下更易提升創面愈合速度，本研究同樣證實濕性密閉的愈合環境有利于成纖維細胞合成及肉芽組織形成，促進上皮細胞的增殖，縮短愈合時間。

3.3 MSCs凝膠能夠促進壓瘡創面愈合且在干性愈合環境中的作用更優 MSCs在骨髓、脂肪、臍血及胎盤等組織中廣泛存在，胎盤MSCs、取材方便、無倫理學爭議，是一種可靠的細胞來源[11]。水凝膠是由親水性聚合物、共聚體或單體大分子組成的高分子材料，可搭載細胞、小分子藥物用于治療。目前已有研究將MSCs凝膠應用于子宮內膜損傷[12]、結腸炎[13]等治療，均表現出較好的作用效果。本研究發現，各時段GG組和SG組的創面愈合率均高于對照組，且高于SL組，提示應用MSCs凝膠能有效提高創面的愈合速度；MSCs的免疫調節功能可抑制炎癥，改善創面的微環境[14]。本研究發現，與對照組相比，GG組和SG組血清TNF-α水平降低，血清IL-10和VEGF水平升高，提示MSCs凝膠可顯著上調VEGF、IL-10的表達水平，下調TNF-α表達，減輕創面的炎癥反應程度，促進血管發生及增強血管的穩定性。

雖然MSCs凝膠具有吸水與供水能力，在創面組織可發生反復水合作用，但MSCs凝膠是否適用于濕性愈合環境尚不清楚，本研究發現，GG組多個時點的創面愈合率高于SG組，表明MSCs凝膠在干性環境的作用效果優于濕性環境。這可能是因為MSCs移植治療中存活率存在問題，其很有可能在未發揮生物學功能前已被不利的微環境所阻礙[15]。由于4期PU傷口滲液常常大量滲出，超過敷料及自身組織的承受能力，濕性密閉環境下易引發傷口浸潤[16]。同時滲液中的炎性介質影響干細胞的作用微環境及活性，影響其修復能力，導致傷口愈合減緩。

綜上所述，在四期PU的治療中，MSCs凝膠在干性愈合環境中可提高PU創面愈合率，優于濕性愈合環境，其機制可能為減輕創面炎癥反應、促進血管新生。但在MSCs的應用過程中是否存在作用于其他細胞因子或信號通路，有待更多樣本量的深入研究。