加速溶劑萃取結(jié)合親水交互色譜法同時測定油料種子中多種生育酚及生育三烯酚

董 基

（肇慶學(xué)院 食品與制藥工程學(xué)院，廣東 肇慶 526061）

維生素E又名生育酚，是人體必需的一種脂溶性維生素。根據(jù)生育酚色環(huán)上的甲基數(shù)目及位置的不同，可分為α-生育酚（α-tocopherol，α-T）、β-生育酚（β-tocopherol，β-T）、γ-生育酚（γ-tocopherol，γ-T）、δ-生育酚（δ-tocopherol，δ-T）以及不飽和形式的α-生育三烯酚（α-tocotrienol，α-T3）、β-生育三烯酚（β-tocotrienol，β-T3）、γ-生育三烯酚（γ-tocotrienol，γ-T3）、δ-生育三烯酚（δ-tocotrienol，δ-T3）[1-2]。生育酚異構(gòu)體對人體具有重要的生理作用，如能夠阻斷自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、降低低密度膽固醇生物合成等[3-5]。針對常見的油料種子，如花生、油菜籽、芝麻、大豆等，有必要明確此類油料種子中生育酚異構(gòu)體的種類及含量，對其進(jìn)一步的利用具有重要意義。

目前，生育酚的檢測方法主要有高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法[6-9]、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）法[10]、氣相色譜（gaschromatography，GC）法[11]、毛細(xì)管電泳法等[12]，但對8種生育酚異構(gòu)體同時檢測的方法鮮有報道。毛細(xì)管電泳法靈敏度較低，且對脂溶性成分的分離難度大。高效液相色譜法與氣相色譜法比較，前處理過程相對簡單，更適用于生育酚的檢測，但要達(dá)到8種生育酚異構(gòu)體的同時分離檢測，對分離手段有著更高的要求。

加速溶劑萃?。╝ccelerated solvent extraction，ASE）是一種新的萃取技術(shù)[13]，它能在高溫高壓條件下使樣品與液態(tài)溶劑充分接觸，從而能夠快速和高效萃取樣品基質(zhì)中的分析物。ASE法自動化程度高，全程避光且與氧氣接觸少，很好的避免了試驗過程中生育酚異構(gòu)體的氧化分解，而且耗時短，有機(jī)試劑消耗少，是對油料作物樣品理想的前處理方法。本研究采用ASE技術(shù)對油料種子樣品中的8種生育酚異構(gòu)體進(jìn)行提取，選用親水液相色譜（hydrophilic liquid chromatography，HILIC）技術(shù)[14-15]，并聯(lián)用靈敏度與選擇性較高的熒光檢測器，對8種生育酚及異構(gòu)體進(jìn)行分離檢測，為8種生育酚異構(gòu)體的定性與定量檢測提供一種高效可行的色譜檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

α-生育酚（純度99.2%）、β-生育酚（純度99.4%）、γ-生育酚（純度99.2%）、δ-生育酚（純度99.6%）、α-生育三烯酚（純度99.0%）、β-生育三烯酚（純度99.6%）、γ-生育三烯酚（純度99.0%）、δ-生育三烯酚（純度99.0%）標(biāo)準(zhǔn)品：德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；正己烷、叔丁基甲基醚、四氫呋喃、甲醇（均為色譜純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；花生、油菜籽、芝麻、大豆等油料種子樣品：市售。

1.2 儀器與設(shè)備

1120型加速溶劑萃取儀：中國北京吉天公司；Agilent 1200高效液相色譜儀：美國安捷倫公司；Sunfire硅膠柱（2.1 mm×100 mm，5 μm）：艾杰爾飛諾美公司；BEH Amide HILIC色譜柱（2.1 mm×100 mm，3 μm）：日本島津有限公司；BUCHI 旋蒸儀：瑞士BUCHI公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取2 g油料種子，2 g硅藻土，混勻后裝入萃取池中。選擇正己烷為萃取劑，萃取溫度110 ℃，壓強10.0 MPa，靜態(tài)提取180 s，循環(huán)3次。將收集到的提取液轉(zhuǎn)移至旋蒸瓶旋蒸至干，采用流動相定容至2.0 mL，0.22 μm濾膜過濾后分析。

1.3.2 儀器條件

色譜條件：BEH Amide HILIC色譜柱（2.1 mm×100 mm，5 μm）；流動相：90%正己烷/10%叔丁基甲基醚-四氫呋喃-甲醇（20∶1∶0.1，V/V）；流速：1.0mL/min；進(jìn)樣量10μL，柱溫30℃。

熒光檢測器參數(shù)：激發(fā)波長294 nm，發(fā)射波長328 nm。

1.3.3 色譜條件的優(yōu)化

用于親水交互作用色譜的色譜柱固定相一般為極性，這樣易吸附樣品溶液中的極性分子，促進(jìn)目標(biāo)物從流動相中分配至固定相表面上的極性液層。參考相關(guān)文獻(xiàn)[16-18]，本試驗考察了Sunfire硅膠柱、BEH Amide HILIC色譜柱兩種色譜柱對生育酚異構(gòu)體分離效果的影響。

1.3.4 加速溶劑萃取條件的優(yōu)化

影響ASE提取效果的因素一般有萃取劑、萃取溫度、靜態(tài)萃取時間[19-21]，因此，本試驗分別考察萃取劑（石油醚、乙醚、正己烷、正己烷-乙醚（1∶1，V/V）、正己烷-石油醚（1∶1，V/V））、萃取溫度（90 ℃、100 ℃、110 ℃、120 ℃、130 ℃）、靜態(tài)萃取時間（60 s、120 s、180 s、240 s、300 s）對萃取后各組分回收率的影響。試驗選擇大豆種子作為樣品基質(zhì)，添加1.0 mg/kg加標(biāo)濃度，分別通過改變上述條件后測定的結(jié)果計算各組分的回收率。

1.3.5 方法學(xué)驗證

取各標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)10.0 mg，用乙醇定容至10 mL，按照GB 5009.82—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中維生素A、D、E的測定》校準(zhǔn)儲備液濃度。按需求轉(zhuǎn)移一定量的儲備液至進(jìn)樣瓶，40 ℃氮吹干后用流動相稀釋成混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列，4種生育酚質(zhì)量濃度均為0.5 μg/mL、1.0 μg/mL、5.0 μg/mL、10.0 μg/mL、20.0 μg/mL、40.0 μg/mL、80.0 μg/mL，4種生育三烯酚質(zhì)量濃度均為0.5 μg/mL、1.0 μg/mL、2.0 μg/mL、4.0 μg/mL、8.0 μg/mL、15.0 μg/mL、30.0 μg/mL。在優(yōu)化好的色譜條件下，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。并選擇大豆種子作為樣品基質(zhì)，分別添加0.3 mg/kg、1.0 mg/kg和3.0 mg/kg的生育酚異構(gòu)體混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行加標(biāo)回收實驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

為了更好地與ASE方法銜接，本試驗選用了正相色譜法來分離檢測8種生育酚異構(gòu)體。硅膠柱是正相色譜分離生育酚異構(gòu)體的常用柱，而本試驗首次將BEH Amide HILIC色譜柱應(yīng)用于正相色譜系統(tǒng)中生育酚異構(gòu)體的分離檢測，并與硅膠柱的分離效果進(jìn)行對比，結(jié)果見圖1。

圖1 BEH Amide HILIC色譜柱（a）及Sunfire硅膠柱（b）分離生育酚異構(gòu)體混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖Fig.1 Chromatogram of mixed standard solution of tocopherol isomer separated by BEH Amide HILIC column (a) and Sunfire silicagel column (b)

由圖1可知，使用BEH Amide HILIC色譜柱較硅膠柱分離出的8種目標(biāo)峰的分離度更好，峰形更對稱，保留時間也更穩(wěn)定，因此，本方法選用BEH Amide HILIC色譜柱作為色譜分離柱。

2.2 加速溶劑萃取條件的優(yōu)化

2.2.1 萃取劑對目標(biāo)物回收率的影響

維生素E族為脂溶性維生素，易溶于有機(jī)溶劑而不易溶于水溶液，因此本實驗選取了石油醚、乙醚、正己烷、正己烷-乙醚（1∶1，V/V）、正己烷-石油醚（1∶1，V/V）作為萃取劑進(jìn)行比較，在萃取溫度110 ℃，靜態(tài)萃取120 s時間，計算各組分的加標(biāo)回收率，結(jié)果見圖2。

圖2 不同萃取劑對目標(biāo)物回收率的影響Fig.2 Effect of different extractants on the recovery of target compounds

由圖2可知，采用正己烷萃取時，8個目標(biāo)組分的回收率最高，石油醚次之，正己烷-乙醚以及正己烷-石油醚混合溶劑的萃取效果較差，且不同類型萃取劑間目標(biāo)組分的回收率差異顯著（P＜0.05），因此，選擇正己烷作為最佳ASE溶劑。

2.2.2 萃取溫度對目標(biāo)物回收率的影響

萃取溫度是加速溶劑萃取的重要參數(shù)。高溫有利于萃取效率的提高，溫度增加，溶劑黏度降低，溶劑對基質(zhì)的浸潤能力增強，溶劑對分析物質(zhì)的溶解能力增大。而且高溫能夠加速分析組分向基質(zhì)表面擴(kuò)散，萃取效率從而得到提高。本試驗以正己烷為ASE溶劑，分別在萃取溫度90 ℃、100 ℃、110 ℃、120 ℃、130 ℃條件下，靜態(tài)萃取120 s，考察萃取溫度對各種組分回收率的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 不同萃取溫度對目標(biāo)物回收率的影響Fig.3 Effect of different extraction temperature on the recovery of target compounds

由圖3可知，當(dāng)萃取溫度低于110 ℃時，各組分的提取量隨著溫度的升高而增加；當(dāng)萃取溫度為110 ℃時，各組分的回收率最高，都能達(dá)到80%以上，且不同萃取溫度間目標(biāo)組分的回收率差異顯著（P＜0.05）；當(dāng)繼續(xù)提高萃取溫度，各組分的回收率開始下降。造成此現(xiàn)象的原因可能是由于溫度過高，熱溶劑的蒸發(fā)導(dǎo)致提取量的降低。綜合考慮，選擇110 ℃作為最佳ASE溫度。

2.2.3 萃取時間對目標(biāo)物回收率的影響

萃取時間的長短與樣品中待提取成分在溶劑中的擴(kuò)散程度有關(guān)，增加萃取時間有利于待萃取物質(zhì)從樣品基質(zhì)擴(kuò)散到萃取溶劑中。本試驗以正己烷為ASE溶劑，萃取溫度為110 ℃，分別靜態(tài)萃取60 s、120 s、180 s、240 s、300 s，考察萃取時間對各種組分回收率的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 不同萃取時間對目標(biāo)物回收率的影響Fig.4 Effect of different extraction time on the recovery of target compounds

由圖4可知，在萃取時間在60～180 s范圍內(nèi)，隨著萃取時間的延長，各組分的提取量呈現(xiàn)增加的趨勢；萃取時間達(dá)到180 s時，各組分的回收率最高；繼續(xù)延長時間，各組分的提取量基本不變，回收率差異不顯著（P＜0.05）。綜合考慮，選擇180 s作為最佳ASE時間。

2.3 方法學(xué)驗證

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

將8種生育酚異構(gòu)體系列標(biāo)準(zhǔn)工作液（4種生育酚質(zhì)量濃度0.5～80.0 μg/mL，4種生育三烯酚質(zhì)量濃度0.5～30.0 μg/mL）按上述優(yōu)化后的儀器條件進(jìn)行測定，繪制目標(biāo)物質(zhì)量濃度（X）與峰面積（Y）的標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸分析。依據(jù)色譜峰信噪比的3倍確定檢出限（limit of detection，LOD），信噪比的10倍確定定量限（limitof quantitative，LOQ）。8種目標(biāo)化合物的保留時間、線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)R2、檢測限及定量限見表1。

表1 8種目標(biāo)物的保留時間、線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限與定量限Table 1 Retention time,linear regression equation,correlation coefficient,detection limit and quantitation limit of eight targets

由表1可知，8種目標(biāo)物回歸方程的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2在0.995～0.999之間，方法的檢出限為32～70 μg/kg，定量限為96～210 μg/kg。

2.3.2 加標(biāo)回收實驗

在已知生育酚異構(gòu)體含量的大豆種子樣品中添加0.3 mg/kg、1.0 mg/kg和3.0 mg/kg的生育酚異構(gòu)體混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，于暗處放置30 min，按上述所建立的方法進(jìn)行樣品的前處理和測定，計算加標(biāo)回收率，結(jié)果見表2。由表2可知，各生育酚異構(gòu)體的加標(biāo)回收率在86.3%～99.2%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）（n=5）在2.5%～6.1%之間，表明該方法準(zhǔn)確度良好。

表2 方法的回收率試驗結(jié)果Table 2 Results of recoveries rate tests of the method

2.4 實際樣品的檢測

在優(yōu)化的試驗條件下，對花生、油菜籽、芝麻、大豆共4種樣品中的生育酚異構(gòu)體含量進(jìn)行分析，采用保留時間定性，外標(biāo)法定量，結(jié)果見表3。

表3 樣品中生育酚及異構(gòu)體含量的測定結(jié)果Table 3 Determination results of tocopherol and isomer contents in the samplesmg/kg

由表3可知，油料種子中皆富含多種生育酚異構(gòu)體，但各生育酚異構(gòu)體的含量分布差異較大。在所檢測的樣品中，花生具有最大的α-生育酚含量，大豆中同時存在8種生育酚異構(gòu)體，芝麻中生育酚異構(gòu)體總量較低且異構(gòu)體種類相對其他樣品少。樣品中生育酚異構(gòu)體的分離狀況見圖5。結(jié)果表明，在本試驗設(shè)定條件下樣品及標(biāo)準(zhǔn)樣品均能得到較好分離。

圖5 不同批次樣品中生育酚及異構(gòu)體色譜圖Fig.5 Chromatogram of tocopherol and isomer in different batches of samples

3 結(jié)論

本試驗建立了加速溶劑萃取結(jié)合親水交互作用色譜法同時測定油料種子中8種生育酚異構(gòu)體含量的方法。樣品在110 ℃條件下經(jīng)正己烷萃取180 s后，采用90%正己烷/10%叔丁基甲基醚-四氫呋喃-甲醇（20∶1∶0.1，V/V）流動相體系，經(jīng)BEH Amide HILIC色譜柱分離，由熒光檢測器外標(biāo)法定量。4種生育酚在0.5～80.0 μg/mL、4種生育三烯酚在0.5～30.0 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2為0.9995～0.999，檢出限為32～70 μg/kg，定量限為96～210μg/kg。加標(biāo)回收率為86.3%～99.2%，RSD為2.5%～6.1%，該方法具有操作簡單、靈敏度高、回收率和重現(xiàn)性好，結(jié)果準(zhǔn)確可靠的特點，為進(jìn)一步研究天然食物中脂溶性維生素異構(gòu)體的分布提供了一種簡單、快速的研究方法。