傳統山西老陳醋熏醅工藝過程風味物質及功能活性成分的變化

劉丹彤，劉 峰，康帥帥，孫建平，王宏霞，許 女*

（1.山西農業大學 食品科學與工程學院，山西 晉中 030801；2.山河醋業股份有限公司，山西 和順 032700）

作為我國傳統四大名醋之一的山西老陳醋，其釀造工藝獨特，采用夏伏曬冬撈冰和熏醋等特色工藝使其色澤醬紫，醇香綿柔。熏醅是山西老陳醋釀造獨特工藝，是山西老陳醋色、香、味的重要來源，從而決定了老陳醋的獨特品質[1-2]。在傳統熏醅過程中主要反應為美拉德反應，并且溫度、水分等都是影響美拉德反應的重要因素。高溫條件下美拉德反應會產生大量酮類、醛類、酚類及吡嗪類物質，研究表明，熱加工過程能夠使酚類化合物降解，由結合態不溶性多酚變為游離態水溶性多酚，從而提高抗氧化活性[3]。

熏醅作為山西老陳醋釀造過程的核心工藝，賦予了山西老陳醋獨特的風味物質。李江涌等[4]對山西老陳醋熏醅前后香氣成分的變化進行研究，結果發現山西老陳醋熏醅前后香氣成分分別為58種和51種，主要包括醇類、醛類、酸類、酯類和雜環類化合物等，其中乙酸含量較高，為23.16%。王愛莉等[5]的研究結果表明，山西苦蕎老陳醋熏醅前共檢測出21種香氣物質，熏醅后檢測到29種香氣物質，在熏醅第3天香氣物質種類最多，達到31種。鎮江香醋的煎醋工藝與涼州熏醋也都是通過提高溫度促進水解反應和美拉德反應，產生大量的雜環類吡嗪、醛類、酮類等風味物質。魏永義[6]對鎮江香醋煎醋前后的風味物質進行研究，煎醋前后酮類含量分別為17.96%和25.49%，煎醋后酸類含量達到32.38%。韓慶輝等[7]檢測到涼州熏醋熏醅前后的揮發性成分分別為58種和57種。

美拉德反應是熏醅過程中存在的一種非酶褐變，除了產生較多的風味物質外，還可以產生黃酮、多酚、川芎嗪等功能性物質。閆霞等[8]研究發現，山西老陳醋生產過程中總酚含量、總黃酮含量在醋酸發酵階段開始增加，熏醅時達到最高。陳俊樹等[9]對山西老陳醋釀造過程中總多酚及總黃酮含量進行研究，總多酚含量在熏醅末期達到1.36 mg/mL，總黃酮含量在熏醅末期達到0.775 mg/mL。除黃酮多酚外，川芎嗪也是山西老陳醋中主要的風味物質。孫宗保等[10]進一步研究顯示，川芎嗪在糖化和酒精發酵時期尚未形成，其合成起始于醋酸發酵階段；煎醋和陳釀均有利于川芎嗪含量的增加。王潔瓊等[11]采用高效液相色譜法（high-performance liquid chromatography，HPLC）對熏醅階段川芎嗪進行定量分析，結果顯示川芎嗪含量在熏醅前3 d上升較快，熏醅后期變化較小，較為穩定，最高達到40.58 μg/mL。劉娜[12]對鎮江香醋中川芎嗪的形成機制進行了研究，乙偶姻是川芎嗪合成的關鍵前體物質，且由微生物酶作用催化生成，在鎮江香醋醋酸發酵階段中，主要底物乙醇可在各類酶催化作用下經乙醛、乙酸、乙酰輔酶A等中間產物生成丙酮酸；另外，其他底物如葡萄糖可通過糖酵解途徑生成丙酮酸，丙酮酸在α-乙酰乳酸合成酶催化下生成α-乙酰乳酸。酸性條件下，α-乙酰乳酸可自然氧化脫羧（非酶促反應）生成雙乙酰，2,3-丁二酮可在雙乙酰還原酶催化下還原為3-羥基丁酮（乙偶姻）；同時，α-乙酰乳酸可在α-乙酰乳酸脫羧酶催化下生成乙偶姻。乙偶姻可在2,3-丁二醇脫氫酶或雙乙酰還原酶作用下生成2,3-丁二醇。因此，準確測定山西老陳醋中乙偶姻和川芎嗪的含量對山西老陳醋保健功能的開發及川芎嗪生成機理的探索具有重要意義。

目前，國內對于山西老陳醋的香氣成分分析已有報道，但對于山西老陳醋熏醅階段風味物質和功能性物質的報道還鮮有研究。本研究將對山西老陳醋傳統熏醅工藝過程中理化指標、風味物質及功能性物質的變化進行研究，為山西老陳醋提質增效提供理論依據，對山西老陳醋熏醅生產過程的控制及工藝的改進提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山西老陳醋熏醅樣品：山河醋業股份有限公司。

氫氧化鈉、甲醛（均為分析純）：天津市天利化學試劑有限公司；硫酸銅、次甲基藍、亞鐵氫化鉀、葡萄糖、磷酸二氫鉀（均為分析純）：天津市恒興化學試劑有限公司；蛋白胨、瓊脂（均為生化試劑）：北京奧博星生物技術有限公司；草酸、丙酮酸、酒石酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸（純度均＞98%）：天津市光復精細化工研究所。

1.2 儀器與設備

Trace1300氣相色譜儀、UItimate 3000高效液相色譜儀、ISQ質譜儀、HP-5-MS氣相色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 mm）、Venusil MP C18液相色譜柱（4.6 mm×150 mm×5 μm）：賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 山西老陳醋熏醅過程理化指標的測定

山西老陳醋熏醅過程中的熏醅溫度直接采用溫度計進行測定；采用pH計測定其pH值；樣品水分含量采用質量法測定；可溶性固形物含量測定采用手持糖度計法[13]：總酸、氨基酸態氮含量測定參照GB/T 5009.39—2003《醬油衛生標準的分析方法》[14]；還原糖含量測定參照GB/T 19777—2013《地理標志產品山西老陳醋》[15]；不揮發酸：參照GB/T 18187—2000《釀造食醋》中單沸式蒸餾法[16]。

1.3.2 山西老陳醋熏醅過程有機酸的測定

有機酸測定采用高效液相色譜法。樣品前處理：用超純水浸泡樣品3 h，進行抽濾，抽濾完成后將濾液稀釋至一定濃度，用12 000 r/min離心10 min，然后用0.22 μm微孔濾膜過濾上清液，即可進樣。色譜檢測條件：液相系統為UItimate 3000，Venusil MP C18液相色譜柱（4.6 mm×150 mm×5 μm），流動相為pH=2.7的20 mmol/L NaH2PO4，進樣量為20 μL，流速為0.8 mL/min，紫外檢測器波長210 nm，柱溫為室溫。

定性方法：按照以上的色譜條件進樣，測定出不同有機酸標準品的保留時間，然后利用各有機酸的保留時間定性。

定量方法：按照上述的色譜條件，將不同濃度的有機酸標準液分別進樣，采用峰面積外標法定量，對各有機酸的標準曲線方程進行計算。

1.3.3 山西老陳醋熏醅過程揮發性香氣成分的測定

揮發性香氣成分測定采用氣-質聯用法。色譜條件：色譜柱為HP-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 mm），載氣為純度99.999%的氦氣（He），流量1 mL/min，不分流。程序升溫：起始溫度40 ℃，保持3min以4 ℃/min的速度升至160 ℃，保持1 min，再以10 ℃/min的速度升至270 ℃保持5 min。質譜條件：接口溫度280 ℃，電子電離（electron ionization，EI）源，離子源溫度280 ℃，電子能量70 eV，掃描質量范圍41～500 amu[17]。

定性方法：鑒定結果由保留指數、標準品、美國國家標準技術研究所（National Institute of Standards and Technology，NIST）08譜庫檢索和人工圖譜解析共同確定。

定量方法：采用面積歸一化法進行定量分析。

1.3.4 山西老陳醋熏醅過程功能物質的測定

樣品前處理同1.3.1，總黃酮含量使用紫外分光光度法進行測定[11]；多酚含量采用福林酚法進行測定[11]；乙偶姻含量采用肌酸比色法進行測定[18]；川芎嗪含量采用高效液相色譜法進行測定[19]。

2 結果與分析

2.1 山西老陳醋熏醅過程理化指標的變化

傳統熏醅是將一半的醋醅置于熏醅缸內加熱，每天依次倒缸一次，熏制5 d后出醅。由圖1a可知，熏醅過程中，溫度不斷升高。在熏醅過程中主要產生美拉德反應，溫度是影響美拉德反應的重要因素，溫度升高，美拉德反應的褐變速度就加快，溫度每升高10 ℃，其反應速度提高3～5倍[20]。但實際生產中，熏醅的溫度一般控制在60～90 ℃，溫度過低不利于反應的正常進行，溫度過高則會使物料焦糊發苦，影響老陳醋品質。整個熏醅過程中水分含量都在65%左右，變化不大。在山西老陳醋熏醅過程，水分過高會使熏醅的氧化面積減少，從而導致老陳醋的風味和色澤變差[21]。

圖1 山西老陳醋熏醅過程理化指標動態變化Fig.1 Dynamics changes of physicochemical indexes of Shanxi aged vinegar during fumigation process

由圖1b可知，在熏醅過程中，熏醅還原糖和可溶性固形物的含量均呈現先增加后下降的趨勢，第2天達到最大值，分別為1.53 g/100 g、19.5%。還原糖含量的升高可能是由于熏醅過程中水分的不斷蒸發，而使還原糖的濃度提高；或是熏醅中的殘余淀粉、蛋白質、半纖維素、菌體等物質在弱酸性熱環境中緩慢地水解，生成還原糖和氨基酸，使其含量升高。生成的還原糖可轉化為酸類物質或醇類物質，使得其含量有所下降?？扇苄怨绦挝镏饕ㄌ?、蛋白質和纖維素等，是評價老陳醋品質優劣的一項重要指標?？扇苄怨绦挝锖枯^低，則老陳醋加上品質較差，或者有可能是未經過發酵釀造過程的產品[22]。

在山西老陳醋的釀造中，總酸含量決定著醋風味和口感是否醇香，是反應山西老陳醋發酵狀態變化的一個重要指標。由圖1c可知，熏醅過程中醅體的pH值呈緩慢下降，pH最低達到了3.93，總酸和不揮發酸呈上升趨勢。熏醅過程中由于水分蒸發導致總酸和不揮發酸濃度相對增加，從而pH下降。

氨基酸態氮是原料中的蛋白質經多種酶的作用降解為氨基酸，氨基酸經過美拉德反應，與還原糖反應生成雜環類物質，為山西老陳醋提供特有的熏香味道[23-24]。由圖1d可知，熏醅中氨基酸態氮的含量呈現先增加后下降的趨勢，第3天達到最大值，為0.27 g/100 g，這是由于高溫環境下水解產生的還原糖與氨基酸發生了羰氨反應。熏醅中不揮發酸的含量呈現上升趨勢，并在熏醅第5天達到1.75 g/100 g，其作為山西老陳醋發酵過程中重要風味產物之一，可以減緩老陳醋總酸含量較高所導致的刺激性酸味口感，使之酸味更加柔和、醇厚[25]。

2.2 山西老陳醋熏醅過程有機酸的變化

老陳醋中的有機酸來源于原料、制曲及發酵過程中，主要由乳酸菌和醋酸菌以及多種微生物產生[26]。由表1可知，在熏醅過程中，有機酸總量整體呈現先下降后上升再下降的趨勢，在熏醅第4天達到最大值，第5天有所降低為3.28 g/100 g，其原因可能是由于酸類物質在微生物的作用下生成酯類物質，使得有機酸總量下降。乳酸和乙酸在熏醅第5天的含量之和占到熏醅第5天有機酸總量的68.9%，其余6種有機酸在熏醅第5天含量之和僅占到有機酸總量的31.1%。

乙酸是8種有機酸中唯一的揮發性酸，同時也是山西老陳醋中的主體酸。由表1可知，乙酸在熏醅過程中整體呈現先上升后下降的趨勢，乙酸在熏醅第4天含量最高第5天有所下降，最高達到1.54 g/100 g，這主要是由于隨著熏醅過程溫度的不斷升高以及熏醅中特殊的翻醅工藝，使得乙酸不斷揮發含量減少。乳酸是山西老陳醋中重要的酸類物質，其酸味溫和適中可以中和乙酸帶來的刺激性口感，使得老陳醋酸而不澀。由表1可以看出，乳酸在熏醅階段呈現上升的趨勢，在熏醅第5天達到最大值，為1.21 g/100 g，占到熏醅第5天有機酸總量的36.89%。這主要是由于乳酸是不揮發性酸，隨著時間的延長，乳酸不斷積累使其含量上升。

表1 山西老陳醋熏醅過程中有機酸成分動態分析Table 1 Dynamic analysis of organic acid components of Shanxi aged vinegar during fumigation process g/100 g

由表1可知，山西老陳醋熏醅過程中，丙酮酸、檸檬酸、琥珀酸、草酸在熏醅過程中均呈現先下降后上升的趨勢，且都在熏醅第5天含量達到最大值，分別占到第5天有機酸總量的3.05%、4.57%、8.23%和9.45%。丙酮酸在酶的催化作用下形成乙酰輔酶A，二者均是醋微生物群代謝網絡中的中心化合物。乙酰輔酶A繼而參與三羧酸循環（tricarboxylic acidcycle，TCA），通過TCA循環生成了山西老陳醋中主要的有機酸檸檬酸、琥珀酸和草酰乙酸，草酰乙酸再經酶的催化作用形成草酸[27-28]。蘋果酸在熏醅過程中呈現下降的趨勢，在熏醅第5天含量占到有機酸總量的2.74%。熏醅第5天酒石酸含量占到第5天有機酸總量的2.74%。

2.3 山西老陳醋熏醅過程揮發性香氣的變化

熏醅是山西老陳醋釀造過程中重要的生產工序，是老陳醋獨特熏香的重要來源。熏醅過程中揮發性香氣成分變化情況見由表2和圖2。由表2和圖2可知，在熏醅過程中共檢測到64種風味物質，其中31種酯類、5種酸類、6種醇類、10種醛類、3種酚類及9種其他類。在熏醅末期相對含量較高的是醛類28.82%、酯類26.76%、酸類6.84%、醇類6.1%、酚類1.89%。就單一揮發性香氣成分而言，3-甲基丁醇、2,3-丁二醇、辛酸-3-甲基丁酯、丁二酸二乙酯、2-羥基丙酸乙酯、2-壬烯醛、十二烷酸甲酯、單羥基苯甲酸等一些酯類和醇類物質在熏醅前期含量較多，到熏醅第5天含量有所下降。乙酸異戊酯、辛酸乙酯、3-壬稀酸乙酯、庚酸乙酯、石竹烯和乙酸辛酯在熏醅第2天是含量達到最大值；1-壬烯-4-醇、12,15十八碳二烯酸甲酯、十五烷酸甲酯和乙酸乙酯在熏醅第1天是含量達到最大值。四甲基吡嗪、糖醛、乙酸戊酯、丁二酸單炔酯、壬醛、苯甲醛、2-甲氧基酚等一些酯類、醛類、酚類和雜環類物質在熏醅前期含量較少，隨著熏醅過程不斷積累。

表2 山西老陳醋熏醅過程中揮發性香氣成分動態分析Table 2 Dynamic analysis of volatile aroma components in Shanxi aged vinegar during fumigation process

續表

圖2 山西老陳醋熏醅過程揮發性香氣成分熱圖Fig.2 Heat map of volatile aroma compounds in Shanxi aged vinegar during fumigation process

酯類化合物的形成主要是因為發酵過程中酸的酯化反應，具有果香、脂肪氣味；酯類的揮發性香氣含量在熏醅第2天中含量最高為37.6%，隨后下降至熏醅第5天的26.76%，其中乙酸乙酯、丁二酸單甲酯、辛酸乙酯、乙酸-2-苯乙酯含量較高。在熏醅后酯類物質及含量均明顯減少，可能是因為醋醅中大多數的酯類化合物在熏醅過程中由于溫度過高而分解。乙酸乙酯是山西老陳醋中最重要的酯類物質之一，也是極為重要的香氣成分，可由一些耐熱性較好的微生物代謝產生，也可由乙醇和乙酸酯化反應生成[29-30]。

醇類物質可以通過氨基酸的脫羧作用生成，或者通過醛類物質還原產生相應的醇。醇類揮發性香氣成分在熏醅第5天中含量最低，為6.1%，其中2,3-丁二醇和苯乙醇的含量較高。苯乙醇是主要的芳香族化合物，其具有玫瑰花香、甜香的風味，是山西老陳醋中主要的醇類風味物質[29]。在熏醅末期，醇類物質含量降低，這可能是由于醇類在高溫條件下揮發或與酸結合生成酯類物質的結果。

酸類化合物是山西老陳醋中主要的呈酸物質，在熏醅第5天含量最低，為6.84%。乙酸作為熏醅中主要的揮發性酸類物質，其含量的變化直接影響到酸類物質整體的變化，在熏醅第5天，乙酸的相對含量為5.49%。因為傳統熏醅工藝中開放式的倒缸、翻醅等程序，使得熏醅中的水分蒸發速度較快，一些揮發性的酸類物質因揮發作用而含量降低。

醛類物質是熏醅末期產生的一種特有的香氣成分，糖醛是美拉德反應的副產物，五碳糖經微生物的發酵作用形成木糖，木糖再經過不同酶的催化作用形成糖醛，糖醛主要呈現出特有的烤香和焦糖的香氣[31]。醛類物質相對總含量在第5天為28.82%，其中糖醛含量占到醛類物質總量的86.43%，長時間高溫加熱有益于其生成和積累。除糖醛外，苯甲醛、5-甲基-2-呋喃甲醛、苯乙醛、壬醛含量也較高。酚類揮發性香氣成分共檢測到3種：2-甲氧基酚、4-乙基-2-甲氧基酚和2-甲氧基-4-乙烯基苯酚，熏醅第4天中含量最高，為2.70%。

其他類揮發性香氣成分共檢測到9種，熏醅第4天含量最高，為2.81%，其中3-羥基丁酮、2-戊基呋喃和2（3H）二氫-5-戊基呋喃酮含量較高。四甲基吡嗪又叫稱為芎嗪，是山西老陳醋熏醅過程中特有的香氣成分。由于熏醅過程中以美拉德反應為主，隨著熏醅溫度的升高和時間的延長，具有咖啡、堅果烘烤等特殊香氣的雜環類化合物不斷生成并積累，使得山西老陳醋具有其獨特風味[32-33]。

2.4 山西老陳醋熏醅過程功能物質的變化

多酚主要存在于植物源性食品中，高粱等山西老陳醋原料谷物的外種皮中含有大量的多酚類化合物。多酚類物質主要包括酚酸、黃酮類化合物和原花青素等，其酚羥基中的鄰位酚羥基很容易被氧化，并且對活性氧等自由基有較強的捕捉能力，因此具有較高的抗氧化性和清除自由基的能力[34-35]。山西老陳醋熏醅過程的多酚及總黃酮含量變化趨勢見圖3。由圖3a可知，多酚含量在熏醅過程中呈現出先下降后上升的趨勢，熏醅第5天為533.06 μg/mL；黃酮含量在熏醅過程中整體呈現上升的趨勢，在熏醅第5天達到最大值，為627.42 μg/mL。在熏醅末期，多酚和黃酮的含量高于熏醅初期的原因有很多方面：第一，熏醅過程是高溫加熱處理，可以促進美拉德反應的進行，生成還原性中間產物，并且由于溫度不斷升高，原料谷物細胞壁及細胞膜受損，使得胞內多酚類物質流出，溶解于老陳醋中；第二，可能是由于耐熱性微生物在熏醅過程中產生了次生代謝產物，同時長時間高溫加熱，熏醅中的水分會大量蒸發，使得這些物質得到了濃縮[36-37]。

乙偶姻（3-羥基-2-丁酮）是川芎嗪的前體物質，可以經過一系列的酶催化反應生成川芎嗪，吡嗪類化合物也是食醋中重要的功能性物質，是對老陳醋品質評價的一項重要指標。由圖3b可知，山西老陳醋熏醅過程中乙偶姻和川芎嗪含量在老陳醋熏醅階段均呈現上升趨勢，在熏醅第5天時含量最高，分別達到1.06 mg/mL、53.64 μg/mL。在熏醅初期川芎嗪含量呈現上升趨勢可能是因為山西老陳醋的原料高粱、大麥等含有豐富的蛋白質、氨基酸等物質可作為美拉德反應的前體物質，并轉化成為雜環類物質使得川芎嗪含量快速上升；或者是由部分耐熱微生物經糖代謝產生乙偶姻，乙偶姻繼續被微生物細胞中的酶催化生成川芎嗪[38-39]。到了熏醅后期，前體物質含量減少，并且由于翻醅的工藝流程，使得少量川芎嗪揮發，但仍呈現上升趨勢。王愛莉等[5]對山西苦蕎老陳醋熏醅過程中揮發性香氣成分變化的研究表明，川芎嗪整體呈現上升趨勢，而乙偶姻則呈現先上升后下降的趨勢，這可能是由于部分乙偶姻在熏醅后期轉化成了川芎嗪或其他物質。王潔瓊等[11]對山西老陳醋傳統工藝釀造而成的燕麥醋的熏醅過程中川芎嗪含量的研究表明，其變化趨勢與本研究相一致。

圖3 山西老陳醋熏醅過程功能物質含量動態變化Fig.3 Dynamics changes of functional substances contents in Shanxi aged vinegar during fumigation process

3 結論

本研究對山西老陳醋熏醅過程中風味物質及功能性物質變化進行研究，結果表示在熏醅過程中共檢測到64種揮發性香氣成分，熏醅過程中有機酸總量呈現先下降后上升再下降的趨勢，熏醅第5天為3.28 g/100 g；多酚呈現先下降后上升的趨勢，熏醅第5天為533.06 μg/mL；總黃酮、川芎嗪和乙偶姻的含量呈現上升趨勢，熏醅第5天達到最大值，分別為627.42 μg/mL、53.64 μg/mL、1.06 mg/mL。山西老陳醋中重要的風味物質及功能活性成分大多在熏醅階段產生，其中發生著復雜的水解反應、美拉德反應、酯類合成及大分子物質的反應，關于其反應機理還需進一步研究。