桑葉活性成分的抑菌作用及穩定性研究

成少寧，董文賓，2，藺毅峰，3，王莎莎，王琴琴

（1.運城職業技術大學 健康學院，山西 運城 044099；2.陜西科技大學 化學與化工學院，陜西 西安 710021；3.運城學院 生命科學系，山西 運城 044000）

新鮮果蔬營養豐富，開胃助食，美味可口。我國果蔬產量雖大，但是歷來重視采前病蟲害防治，忽視采后的貯運及防腐，加上果蔬本身的易腐性，導致我國的果蔬每年的采后腐爛損耗，幾乎可以滿足2億人口的基本營養需求[1]。目前的果蔬防腐保鮮方法中物理法如冷藏投資大、能耗高，化學法如化學殺菌劑環境不友好，植物源抑菌劑具有低毒、無污染、廣譜抗菌性的優點應用于果蔬的防腐保鮮成為當前科研工作研究的熱點[2-4]。桑葉是桑科植物的干燥葉，藥食兩用，相關研究表明桑葉中的營養物質含量豐富，并且含有多糖、生物堿、黃酮等多種生物活性成分，具有降血糖、抗高血脂、抗氧化、抗腫瘤、抗炎和保肝護肝的生理活性[5-7]。桑葉混合提取物對細菌有抑制作用[8-9]，具有植物源殺菌劑的潛力。目前的研究大都集中于對桑葉提取物這一混合物的抑菌作用研究，具體活性成分的抑菌作用比較還鮮有報道。桑葉多糖和黃酮大多為降血糖方面的研究，但是它們的降糖機制不同，還具有降血壓、抗衰老、增強免疫方面的功效[10-11]。桑葉生物堿也多為其生理活性方面的研究，其具有較好的抗氧化、抗炎[12-13]、預防高血脂、高血糖[14]方面的功效。本研究采用水提醇沉法、超聲輔助提取法及醇酸混合溶液提取法分別提取桑葉的多糖、黃酮及生物堿三種活性成分，采用牛津杯法研究桑葉活性成分的抑菌活性，并對桑葉黃酮的最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）和抑菌的穩定性進行探討，為桑葉黃酮的深度開發和防腐保鮮方面的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料

桑葉：學校有機試驗農場10月份（霜后）采摘。

1.1.2 化學試劑

氫氧化鈉、碳酸鈉、氯化鈉、葡萄糖（均為分析純）：廣州白云山光華制藥股份有限公司；無水乙醇（分析純）：西隴科學有限公司；鹽酸（分析純）：洛陽市化學試劑廠；蘆?。兌?8%）：美國Sigma-Aldrich公司；4-羥基哌啶醇（純度99%）：北京百靈威科技有限公司；胰蛋白胨、酵母浸膏、瓊脂粉（均為生化試劑）：北京奧博星生物技術有限責任公司；擴展青霉（Penicillium expansum）、鏈格孢（Alternaria）、灰葡萄孢（Botrytis cinerea）：中國普通微生物菌種保藏管理中心（China General Microbiological Culture Collection Center，CGMCC）；大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）：本學院微生物實驗室。

1.1.3 培養基

Luria-Bertani（LB）液體培養基：950 mL去離子水中加入胰蛋白胨10 g，酵母浸膏5 g，氯化鈉10 g，加熱溶解后用1 mol/L NaOH調節該培養基的pH達到7.0，用去離子水定容至1 L。121 ℃滅菌20 min。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養基：馬鈴薯去皮切塊稱取200 g，加水煮爛，用4層紗布過濾，濾液中加入15 g瓊脂粉加熱溶解，再加入葡萄糖20 g，攪拌均勻后補足水分至1 L。115 ℃滅菌20 min。

馬鈴薯葡萄糖肉湯（potato dextrose broth，PDB）培養基：馬鈴薯去皮切塊稱取200 g，加水煮爛，用4層紗布過濾，加入葡萄糖20 g，攪拌均勻后補足水分至1 L。115 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

DHG-9203A電熱恒溫干燥箱、GNP-9160隔水式電熱恒溫培養箱：上海精宏實驗設備有限公司；TGL-16G高速臺式離心機：上海安亭科學儀器廠；HH-501電子恒溫水浴鍋：常州翔天實驗儀器廠；KQ2200v超聲波處理器：江蘇昆山超聲儀器有限公司；SC-3612低速離心機：安徽中科中佳科學儀器有限公司；SHZ-28A恒溫振蕩培養箱：常州諾基儀器有限公司；RE-2000A旋轉蒸發儀：上海亞榮生化儀器廠；SW-CJ-2D超凈工作臺：蘇州凈化設備有限公司；TUV30W紫外線殺菌燈：飛利浦電器科技集團（中國）有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 桑葉粉制備

采摘新鮮桑葉片去除雜質和梗，自來水清洗干凈，干燥箱55～60 ℃干燥24 h，研磨成粉，過60目篩備用。

1.3.2 桑葉多糖提取及含量檢測

參照文獻[15]的方法提取桑葉干粉中多糖，提取溫度92 ℃、提取時間3.5 h、液料比34∶1（mL∶g），提取次數2次進行熱水浸提，合并2次浸提液離心（4 000 r/min，20 min），濾液真空濃縮（溫度60 ℃）至一定體積，加入3倍體積無水乙醇醇沉，4 ℃放置過夜，離心（4 000 r/min，20 min）得沉淀物，-20 ℃預凍，冷阱溫度-65 ℃、60 h冷凍干燥成粉[15]。

采用文獻[15]的方法進行葡萄糖標準曲線的繪制和桑葉中的多糖含量檢測，得出葡萄糖溶液質量濃度（x）與吸光度值（y）的回歸方程為y=2.994x+0.004，相關系數R2=0.993。按照標準曲線回歸方程計算桑葉多糖含量為0.639 mg/mL，得率為12.78 mg/g。

1.3.3 桑葉黃酮提取及含量檢測

桑葉粉與體積分數為70%乙醇按照料液比1∶20（g∶mL），80 ℃水浴2 h，再放入超聲波處理器中超聲處理35 min，然后過濾將濾渣再次提取一次，4 000 r/min離心20 min，上清液旋轉蒸發定容至50 mL[16]。

采用文獻[16]的方法進行蘆丁標準曲線的繪制和桑葉中的總黃酮化合物含量檢測，得出蘆丁溶液質量濃度（x）與吸光度值（y）的回歸方程為y=0.519x+0.005，相關系數R2=0.998。按照標準曲線回歸方程計算桑葉黃酮含量為0.848 mg/mL，得率為10.18 mg/g。

1.3.4 桑葉生物堿提取及含量檢測

取桑葉干粉5 g，按料液比1∶20（g∶mL）加入體積分數為30%乙醇-0.025 mol/L鹽酸混合溶液，以提取溫度30 ℃，提取時間10 min，提取2次。提取液在室溫條件10 000×g轉速離心5 min，濾渣以同樣條件提取、離心，合并上清液，然后按活性碳：樣品質量比為1∶2加入活性碳，放入恒溫振蕩培養箱220 r/min混勻1 h，取出抽濾，濾液用旋轉蒸發儀濃縮至浸膏狀[17]，檸檬酸溶解浸膏調pH值至2.5，無水碳酸鈉調pH值至10.5，產生生物堿沉淀，離心（4 000 r/min，30 min），棄上清液，沉淀冷凍干燥成粉[18]，用0.05 mol/L鹽酸溶解定容至25 mL。

采用文獻[17]的方法進行4-羥基哌啶醇標準曲線的繪制和桑葉中的生物堿含量檢測。得出4-羥基哌啶醇溶液質量濃度（x）與吸光度值（y）的回歸方程為y=5.662x-0.004，相關系數R2=0.994。按照標準曲線回歸方程計算桑葉生物堿含量為0.004 89 mol/L，得率為2.50 mg/g。

1.3.5 菌種活化及菌懸液的制備

將菌種（鏈格孢、擴展青霉、灰葡萄孢）從安瓿管移至相應的PDA試管斜面，置于28 ℃恒溫培養箱培養48 h，傳代2～3代。大腸桿菌、金黃色葡萄球菌先轉入LB液體培養基中進行活化，再轉入LB試管斜面培養基中，置于37 ℃恒溫培養箱培養24 h，傳代2～3次。分別刮取試面斜面上的菌種入無菌生理鹽水中，并將其稀釋成1.0×106～1.0×108CFU/mL的菌懸液備用。

1.3.6 抑菌活性檢測

采用牛津杯法[19]，用無菌涂布棒將0.1 mL上述制備好的供試菌懸液涂布至相應的無菌平板上，每個平板放置5個直徑為8.0 mm的無菌牛津杯，分別加入桑葉多糖（質量濃度為15.98 mg/mL）、桑葉黃酮（質量濃度為20.35 mg/mL）、桑葉生物堿（質量濃度為3.75 mg/mL）、無菌水（桑葉多糖溶劑）、無水乙醇（桑葉生物堿溶劑）各0.2 mL，每種菌3組平行。放入4 ℃冰箱平衡2 h，細菌放入37 ℃恒溫培養箱培養12 h，真菌放入28 ℃恒溫培養箱培養48 h。取出平板測定其抑菌圈直徑，抑菌圈直徑＞8.0 mm表示其具有抑菌活性，抑菌圈直徑越大，表示其抑菌活性越強。

1.3.7 最小抑菌濃度

采用試管二倍稀釋法[20]測定供試菌株的最小抑菌濃度（MIC），在5個滅菌試管中分別加入LB培養液3 mL，取第1管加入黃酮原液3 mL，混勻后抽取3 mL加入第2管，依此類推，直到第5管抽取3 mL廢棄，在這5管加入供試菌液0.1 mL。另設一管為LB培養液對照組，一管為黃酮提取液對照組，細菌置37 ℃恒溫培養18 h，真菌28 ℃下培養48 h后以不出現渾濁的最高藥物稀釋倍數為該藥的最小抑菌濃度（MIC）。

1.3.8 抑菌穩定性實驗[21]

（1）熱處理對桑葉黃酮抑菌效果的影響

采用抑菌圈法，將桑葉黃酮原液分別于40 ℃、60 ℃、80 ℃、100 ℃下，加熱20 min，考察桑葉黃酮對擴展青霉和金黃色葡萄球菌的抑菌效果。每組做三個平行。

（2）pH對桑葉黃酮抑菌效果的影響

用1 mol/L的HCl或NaOH將2 g/mL的桑葉黃酮原液pH分別調節為5、7、9、11，以未經處理的桑葉黃酮和相對應pH的HCl或NaOH溶液作為對照，常溫平衡30 min后分別進行恒溫培養，用牛津杯法測量抑菌圈的直徑，比較pH對桑葉黃酮抑菌活性的影響。每組做三個平行。

（3）紫外線對桑葉黃酮抑菌效果的影響

在30 W紫外燈下將桑葉黃酮原液分別照射10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min，分別進行恒溫培養后測定其對擴展青霉和金黃色葡萄球菌的抑菌活性，觀察在不同的紫外線照射時間下桑葉黃酮的抑菌效果。每組做三個平行。

2 結果與分析

2.1 桑葉活性物質抑菌效果

由表1可知，桑葉的三種不同活性物質對供試菌的抑菌效果不同，其中桑葉多糖對5種供試菌的抑菌圈直徑均為8.0 mm，表明均無抑制作用；桑葉黃酮對鏈鉻孢的抑菌圈直徑為8.0 mm，表明其無抑制作用，對其余的四種菌抑菌圈直徑均＞8.0 mm，表明均有抑制作用，并且抑菌圈直徑越大抑制效果越好，所以其抑制效果順序為：金黃色葡萄球菌＞大腸桿菌＞擴展青霉＞灰葡萄孢，其對細菌的抑制作用大于真菌，細菌中其對革蘭氏陽性菌的抑制作用大于陰性菌，這可能是因為陽性菌與陰性菌不同的細胞壁結構導致的；桑葉生物堿對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑均＞8.0 mm，并且金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑大于大腸桿菌，表明桑葉生物堿對這兩種菌都具有抑制活性，抑制效果順序為：金黃色葡萄球菌＞大腸桿菌，但對灰葡萄孢、擴展青霉、鏈鉻孢三種真菌的抑菌圈直徑均為8.0 mm，均無抑制性，這與茄非食部分生物堿提取液對細菌和霉菌均具有良好的抑菌效果[22]和苦豆子生物堿浸提物對供試細菌和霉菌都有一定的抑制作用[23]的研究結果不一致，可能是因為不同植物其生物堿的活性成分不同，具體機理還有待進一步的研究。桑葉的三種活性成分中只有桑葉黃酮的抑制作用較為廣泛，因此選擇桑葉黃酮作進一步研究。

表1 桑葉活性成分對常見腐敗菌的抑菌效果Table 1 Antimicrobial effect of active components from mulberry leaf on common spoilage bacteria

2.2 桑葉黃酮對供試菌的最小抑菌濃度

桑葉黃酮提取物對不同供試菌的最小抑菌濃度（MIC）結果見表2。由表2可知，桑葉黃酮提取物對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度最低，為5.09 mg/mL；大腸桿菌其次，為10.18 mg/mL；灰葡萄孢和擴展青霉的最小抑菌濃度最高，為20.35 mg/mL。最小抑菌濃度的大小進一步反映出桑葉黃酮對各種供試菌的抑菌效力，MIC越低，抑菌效力就越強，測定結果與牛津杯法測定出的抑菌效果一致。

表2 桑葉黃酮對不同供試菌的最小抑菌濃度Table 2 Minimum inhibitory concentration of flavonoids from mulberry leaf to different tested bacteria

2.3 桑葉黃酮的抑菌穩定性

2.3.1 熱處理對桑葉黃酮抑菌穩定性的影響

不同溫度處理下的桑葉黃酮的抑菌結果見表3。

表3 不同溫度對桑葉黃酮抑菌穩定性的影響Table 3 Effect of different temperature on the antibacterial stability of flavonoids from mulberry leaf mm

由表3可知，隨著處理溫度在40～100 ℃范圍內的提高，桑葉黃酮對金黃色葡萄球菌、擴展青霉的抑菌圈直徑均無顯著性差異（P＞0.05），說明桑葉黃酮抑菌效果具有良好的熱穩定性。

2.3.2 pH對桑葉黃酮抑菌穩定性的影響

不同pH的桑葉黃酮的抑菌結果見表4。由表4可知，pH對桑葉黃酮的抑菌效果有影響，在酸性條件下桑葉黃酮對兩種菌的抑菌效果與未處理組相比無顯著差異（P＞0.05），但是堿性條件下與未處理組相比抑菌效果都顯著降低（P＜0.05）。原因可能為酸性條件下溶液中離子可以降低活性酚類物質上的酚羥基的電離度，從而使其疏水性增加，易于與微生物表面的蛋白質結合，從而有助于其發揮抑菌作用[24-25]。堿性條件下抑菌活性顯著降低，可能是由于堿性環境破壞了桑葉黃酮的結構（或活性）[21]。因此，桑葉黃酮在酸性條件（pH5～7）下有良好的抑菌穩定性。

表4 pH對桑葉黃酮抑菌穩定性的影響Table 4 Effect of pH on the antibacterial stability of flavonoids from mulberry leaf mm

2.3.3 紫外線對桑葉黃酮抑菌穩定性的影響

不同的紫外線照射時間對桑葉黃酮抑菌效果的影響見表5。紫外線不同的照射時間對金黃色葡萄球菌和擴展青霉的抑菌效果均無顯著差異（P＞0.05），說明紫外線照射不能改變桑葉黃酮中的抑菌活性成分和其活性結構，桑葉黃酮對于紫外線具有良好的穩定性。

表5 紫外照射時間對桑葉黃酮抑菌穩定性的影響Table 5 Effect of ultraviolet treatment time the antibacterial stability of flavonoids from mulberry leaf mm

3 結論

桑葉的三種活性成分對供試菌種抑菌效果結果表明，多糖對細菌和霉菌均無抑制作用，生物堿僅對細菌有抑制作用，桑葉黃酮的抑菌譜最廣，對細菌和霉菌均有抑制作用。桑葉黃酮的抑菌效果為細菌大于霉菌，革蘭氏陽性菌大于革蘭氏陰性菌。其對金黃色葡萄球菌的MIC為5.09 mg/mL，大腸桿菌為10.18mg/mL；灰葡萄孢和擴展青霉為20.35mg/mL。

加熱處理和紫外線照射均對桑葉黃酮的抑菌圈直徑無顯著影響（P＞0.05），但是在pH5～11范圍內會隨著pH的增加而抑菌效果降低，酸性條件對桑葉黃酮的抑菌效果沒有顯著影響（P＞0.05），這可為桑葉黃酮在食品加工或防腐保鮮方面的應用提供理論依據。

本研究中發現桑葉生物堿在抑制金黃色葡萄球菌方面具有非常突出的效果，將在下一步的實驗中進行進一步的研究。